当前位置: 主页 > 常见客户问题问答 > 高效液相色谱是怎样构成的

高效液相色谱是怎样构成的

  
  HPLC 主要测试的是有机物质,无机物质用AAS,UV等光谱仪器,或者用离子色谱测试。
   HPLC的几大系统
  HPLC是集成化很高的仪器。它包括了泵输送流动相,六通阀的进样,色谱柱的分离,检测器的检测和记录积分设备的记录和数据计算构成的。首先先给大家一个总的概念,然后详细阐述。
  3.1    GC和HPLC的工作原理
  气相色谱,我们用氮气或者氦气做载气。“载”这个字,我们怎么理解,载,就是作为介质,带着样品到色谱柱中去“旅游”。有些人个子小,那么在 色谱柱这个迷宫里面,跑得快,有些人个子大,容易被色谱柱中的迷宫中的绳索绊住,所以跑得慢。所以,不同性质的物质在载气的带动下,到色谱柱中旅游,快慢 不同,从而到达检测器时间不同。达到分离的目的。
  那么HPLC呢,同样道理。这里我们把载气换成流动相(Mobile phase)。有些书也称流动相为载液。我们的HPLC是 通过管路连接这各个部件按,流动相在泵的驱动下,流经色谱的全系统到达废液,我们可以把它理解成传输带。样品经过了流通阀,进入色谱系统,在流动相的带领 下,进入色谱柱进行分离。被分离的样品中各个成分,进入检测器,被检测。由记录仪记录检测信号,流经废液。或者被收集。这是HPLC的整个系统工作描述。
  3.2    HPLC的各系统
  那么我概括HPLC是有五大系统构成:动力系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据分析和记录系统构成。
  其中:
  动力系统:泵
  进样系统:六通阀和进样针,或者自动进样器
  分离系统:色谱柱
  检测系统:检测器,一般有紫外检测器,荧光检测器,示差折光检测器,MS检测器等等。
  记录系统:电脑工作站等
  连接这些设备的都是由一根根不锈钢管或者PEEK管构成。
  3.2.1           说泵:
  泵是HPLC的动力系统。气相色谱的动力,实际上是钢瓶中气体的压力。而液体,它只有通过泵的转动而使之流动。
  我 们做一个类比:血液类比成流动相,心脏类比成泵。血管类比成各不锈钢管。那么,血液在心脏作为动力系统,流经着身体的各个系统。如果心脏跳得快点,那么血 流量加大,那么血压升高。同样,泵流速提高,流动相流量增大,那么色谱系统压力增高;如果血管被压迫半堵了,那么同样的心跳速度,压力也会增高。同样道 理,如果色谱系统被污染,那么污染物堵在色谱柱头,或者各连接口等,那么泵同样的流速,就有可能压力变大。高效液相色谱主要出问题的就是压力莫名地增大, 一般认为是色谱系统被污染而堵,解决的方法就是查看各个部件,或者用过滤过的异丙醇清洗流路等。
 
  由四个柱塞杆分别作抽,推运动,吸取贮液瓶中的流动相。想想,医生打针,是否也是抽,推注射器的柱塞杆呢?为什么用了四个柱塞杆呢?目的是为了保持流量的稳定。也就是说,一边抽,一边在推,这样可以减小脉冲。同时,现代的泵的出口流液出,还有一个脉冲调节器,避免由于脉冲引起流速不稳定。我们看下,还有一个purge阀。考下大家purge是 什么意思呢?对了是清洗的意思。这个派什么用处的呢?我们思考下,色谱系统不能用很大的流速的,如果用很大流速,那么仪器是否就会有损害?通俗地说,压力 高了,设备爆了。一般我们更换流动相和排除流动相中的气泡,需要高流速,快速地更换流动相和排除气泡。那么,我们首先是开purge阀,这样流路走的是一条进废液的路,不会进入色谱柱系统,用5-9mL/min的流速快速更换流动相和排除气泡。更换好并且气泡没有了,那么要停泵,关闭阀门,以正常流速开启泵(例如1.0ml/min)。则流动相能够进入各个色谱系统中。
  关于流动相,需要强调两点,色谱系统不能被污染,尤其是试剂中的固体颗粒是损害HPLC色谱分析的元凶。同时,流动相中的气泡,会是的压力不稳,所以,也要想方设法地排除掉。所以,对于流动相,我们必须对它进行处理。主要有两点。
  流动相按照要求配制好。需要进行过滤和脱气。
  过 滤:对于流动相,我们使用微孔滤膜过滤。微孔滤膜有三种规格。有水系的,有机系的,有水系-有机系两用的。我们过滤水相一般使用水系滤膜。其孔径有 0.45微米,0.22微米 。一般选用0.45微米孔径 。因为 0.22微米 过滤 细菌 的。有机相,比如甲醇,乙腈,四氢呋喃等使用 有机系滤 膜。不要搞混了。因为有机系过滤水相,水流不下来的。有机溶剂用水系滤膜,滤膜会被溶解,黏在多孔瓷板上。如果 混合溶剂,一般可以选择水系-有机系两用 滤膜。还有,试液一定需要过滤,以前用过的那些 HPLC的甲醇,乙腈,过滤出来,上面会有一层浅浅的黄色固体颗粒物,也许会有灰尘等固体颗粒物。如果不幸进入色谱系统,那么会造成不必呀的麻烦。虽然色谱仪器可以拆洗,但是,拆洗总归费时费力吧。
  同时流动相需要脱气(degas)。一般脱气 有真空脱气,超声波脱气,吹He脱气,加热脱气。常用前两种。当然也有各自有缺点。
  问一个问题:流动性为什么要脱气呢?
  3.2.2           说说进样系统:
  现在很少用到手动进样了吧。大部分都用自动进样。自动进样确实方便,只要安排好配制过的样品的位次,那么开动sequence run 就一个个地分析了。要不说说手动进样吧。进样设备是一个六通阀。其中要进样的时候,需要将六通阀转到load状态,由于六通阀后面装了一根定量环,所以,样品一定以大于三倍定量环体积地进去,这样,保证定量环中充满着样品,可以避免进样误差。打个比方,如果定量环是20μl的,那么我们打入>60μl的样品。然后转到inj状态,即可。还有需要注意的是,HPLC 的进样针是平头针,而GC的进样针一定是尖头针。因为气相进样要刺穿隔垫,需呀尖头,而尖头容易划伤金属,所以HPLC 用的是平头针。
  3.2.3           说说分离系统。
  分离系统是HPLC的 核心。我们现实生活中需要分析的样品都是混合物。所以,分离后在分析。比如我们分析酱油中肌苷酸鸟苷酸,那么酱油进行稀释处理,注入色谱仪,肌苷酸,鸟苷 酸由于性质不同被分离成两个峰。同时酱油中其他物质也被分离。使得肌苷酸,鸟苷酸两个峰十分清楚地呈现。我们需要清楚的是,样品的测试要保证测试的物质被 有效地分离,而不需要测试的物质,没有必要让其分离,这可以节省分析时间。
  3.2.4           检测系统:
  HPLC的检测器有紫外-可见检测器,(UV-VIS),荧光检测器(FD),示差折光检测器(RI),MS检测器等等对于这些检测器,简单来说,是两点:被检测和浓度越大面积越大。对于示差折光,它是通用性检测器,但是灵敏度不够。测试一些没有紫外基团的物质,比如如糖等。
  3.2.5           记录系统:
  HPLC记录系统主要记录色谱图,并且对色谱图进行面积计算(积分)。同时可以用软件计算出其他,比如峰宽,塔板数,拖尾因子等。同时也可以通过输入称样量和稀释倍数,计算出测试样品中各组分的含量。