季铵盐作为一种阳离子表面活性剂，广泛用作化妆品防腐剂[1,2]。三氯生为广谱抗菌剂，也可作为防腐剂使用[3]。考虑到三氯生、苄索氯铵及苯扎氯铵同系物存在轻微刺激性以及潜在风险[4]，《化妆品安全技术规范（2015版）》规定三氯生限用于洗手皂、浴皂、沐浴液、除臭剂（非喷雾）、化妆粉及遮瑕剂、指甲清洁剂中，最大允许浓度0.3%；苄索氯铵最大允许浓度0.1%；苯扎氯铵同系物以苯扎氯铵计的总量最大允许浓度为0.1%。本方法采用梯度洗脱-高效液相色谱法，可同时测定不同基质化妆品中的三氯生、苄索氯铵及4种苯扎氯铵同系物。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
Waters ACQUITY ARC高效液相色谱仪配PDA检测器，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-CN(4.6mm×250mm,5.0μm),Elma D-78224型超声波清洗仪。乙酸铵（ACS公司）、乙腈（Merck公司）、甲醇（Merck公司）为色谱纯，冰醋酸（南京化学试剂有限公司）为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2标准品
(1)三氯生，购自DR.Ehrenstorfer GmbH;(2)苄索氯铵及苯扎氯铵同系物：十二烷基二甲基苄基氯化铵（表面活性剂1227，简称1227）、十四烷基二甲基苄基氯化铵（表面活性剂1427，简称1427）、十六烷基二甲基苄基氯化铵（表面活性剂1627，简称1627）、十八烷基二甲基苄基氯化铵（表面活性剂1827，简称1827），购自SIGMA公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
流动相：A相为甲醇，B相为0.05mol/L乙酸铵（冰醋酸调节pH至5.0），梯度洗脱，流速为0.8ml/min具体比例见下表1，柱温30℃，检测波长260nm，进样体积10μl。
表1 梯度洗脱比例（%）
1.3.2 标准曲线的配制分别称取30 mg三氯生，甲醇溶解定容至25ml;100mg
1227、160mg苄索氯铵、100mg 1427、100mg 1627、80mg 1827标准品，置于25 ml容量瓶中，用乙腈0.05 mol/L乙酸铵溶液（pH=5.0)=6040(VV）溶解，定容至刻度。分别取0.5ml三氯生、1.0 ml 1 227、0.3ml苄索氯铵、1.0ml 1427、1.0ml 1627、2.0ml 1827，定容至10.0ml，得混合标准应用液溶液，浓度分别为60、400、200、400、400、600mg/L。
混合标准系列的配制：精密量取上述混合标准应用液，用乙腈0.05mol/L乙酸铵溶液逐级稀释得到标准系列：三氯生浓度为3、6、12、24、30、60 mg/L,1 227、1 427及1 627浓度为20、40、80、160、200、400mg/L，苄索氯铵浓度为10、20、40、80、100、200 mg/L,1 827浓度为30、60、120、240、300、600 mg/L系列混合标准浓度。分别取10μl进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。
1.4 线性范围、检出限和定量限
根据标准曲线，确定线性范围。以信噪比（S/N)=3计算检出限，（S/N)=10计算定量限。
1.5 回收率和精密度
在4种不同剂型的样品中分别加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液，按样品的处理方法提取进样，做加标回收实验，并分别重复测定6次做精密度实验，计算各剂型各浓度加标回收率及精密度。1.6样品测定称取适量化妆品样品，加入1.0 ml乙腈混匀，再用乙腈：0.05mol/L乙酸铵溶液（6040）稀释，超声提取20min，定容至刻度，离心取上清液过0.22μm滤膜，10.0μl进样，以保留时间和光谱图定性，根据标准曲线定量。
2 结果
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 波长
6种物质在220nm附近存在末端吸收，苄索氯铵及苯扎氯铵同系物在260nm也有吸收，三氯生在260nm处吸收也可满足检测要求，为保证基线平稳，选用260nm作为检测波长。
2.1.2 梯度洗脱程序选择
参考《化妆品安全技术规范（2015版）》，选用甲醇与乙酸铵缓冲溶液作为流动相，乙酸铵浓度0.1 mol/L与0.05 mol/L无明显区别[5]，考虑到仪器保护等方面，选择浓度较低的0.05mol/L缓冲盐。选用较低流速0.8 ml/min，梯度洗脱保证各组分能基线分离，具体图谱如图1。
图1 6种混合样品标准图谱
注：1：三氯生；2:1227;3：苄索氯铵；4:1427;5:1627;6:1827
2.1.3 色谱柱与柱温选择
本实验选用氰基柱。柱温在25℃、30℃、40℃无明显区别，为了保证实验的重复性，选用30℃测定。
2.2 提取溶剂的选择
三氯生易溶于有机溶剂[6]，季铵盐大多易溶于水和乙醇[7]。化妆品剂型较多成分复杂，为满足绝大多数样品的测定，先加入1 ml乙腈混匀，再以乙腈∶0.05mol/L乙酸铵溶液（60∶40）提取定容[8]。样品图谱见图2。
图2 样品图谱
注：1：苄索氯铵；2:1227;3：三氯生
2.3 方法的线性范围、检出限、定量限
测定6个不同浓度的混合标准系列，以信噪比等于3作检出限，信噪比等于10作定量限，结果见表2。
2.4 方法的回收率和精密度
在4种不同剂型的样品中分别加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液，不同剂型同浓度加标添加量一致，详见表3。按样品的处理方法提取进样，进行加标回收实验，并分别重复测定6次做精密度实验。6种成分各剂型、浓度加标回收率及精密度结果见表4。
2.5 样品测定
按照本方法过程测定10种市售化妆品，其中4种有检出。2种产品检出表面活性剂1227，含量均为0.03%;1种产品检出苄索氯铵，含量为0.07%;1种产品检出三氯生，含量为0.009%。
表2 6种物质标准方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限
表3 6种物质低、中、高浓度加标浓度（mg/L)
表4 不同剂型样品的加标回收率和精密度（n=6)
3 讨论
《化妆品安全技术规范（2015版）》中没有检测三氯生的标准方法，本研究建立的方法可同时测定5种季铵盐类防腐剂和三氯生含量，方法操作简单，可满足日常检测工作的要求。为实现6种化合物的同时测定，本方法测定波长根据季铵盐的最大吸收波长选用260nm，但三氯生最大吸收为280nm波长，在260nm检测会提高检出限，降低检测灵敏度[9]，未来应进一步优化参数以降低三氯生的检出限，提高检测灵敏度。现阶段研究显示化妆品中三氯生的使用存在一定安全隐患[10,11,12]，季铵盐的过度使用大大提高了生物抗药性，其导致的环境污染问题引起普遍重视，应加强监测，减少化妆品中三氯生和季铵盐的使用，努力寻求安全环保的替代材料。
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