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超高效液相色谱柱发展现状

时间:2021-02-03 13:16:03 作者:admin 点击:

 
 
超高效液相色谱(UPLC)技术是在传统液相色谱(HPLC)技术原理的基础上,通过对分离系统整体设计进行优化改造,从而大幅度改善了色谱的分离度、样品通量和灵敏度,也是近些年比较风靡的液相色谱技术[1]。该技术始于2004年,美国Waters(沃特世)公司在色谱柱填料技术上加强了研发创新,促进了HPLC突破性进展,并推出了全球第1台超高效液相色谱仪———ACQUITYTM UPLC[2]。
 
与HPLC相比,UPLC在分离方面有更快的速度,更好的分离度、精密度和稳定性等优越性能,受到使用者越来越多的关注。具体优势[3]:(1)采用小粒径色谱柱,增加单位长度内的理论塔板数,显著提高了色谱分离度,进而增加了分析通量;(2)配备了高精确度的超高压输液泵和高灵敏度的检测器,系统硬件和软件的全面改善,使得UPLC能够承受更高的系统反压,大大提高了色谱峰容量、灵敏度、分析效率;(3)配备了低扩散、低交叉污染的自动进样系统,改善了小体积样品的重复性,在长期稳定性试验中,可获得良好的结果重现性,为中药复杂成分的分离、解析提供了良好的技术平台;(4)色谱柱能够耐受更高的柱温,使得使用者可以在更宽的温度范围内进行方法开发;(5)UPLC的一些重要色谱参数均比HPLC有所改善,如分离时间缩短10倍,流动相消耗减少5倍,色谱峰容量增加2倍,灵敏度和理论塔板数提高3倍,分离度提升了1.7倍,分析效率增加10倍。
 
正因为UPLC实现了如此高的分离度,以及省时、高效率等优势,近些年来,UPLC技术在食品安全、动植物体成分分析、环境分析、药物开发、代谢组学、化工等领域的复杂样品的分析中得到了越来越广泛的应用。
1 色谱柱填料的发展
 
色谱柱相当于液相色谱仪的心脏,因此,色谱柱的发展也是HPLC发展的“先行者”,而填料又是影响色谱柱分离能力的关键因素之一,填料颗粒的比表面积决定其样品容量,与多孔填料相比,无孔填料的比表面积小,直径为1μm的无孔填料的比表面积约为2.7 m2/g,而粒径为1μm的全多孔填料(孔径为10 nm)的比表面积可达300m2/g[4],流动相流速、分离效率以及与填料关系的理论基础是著名Van Deemter方程[5]:
其中:H为理论塔板高度,mm;v为流动相的平均线速度,m L/min;A、B、C为常数,分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数和传质阻力项系数。式(1)各项均与固定相粒径(dp)相关。如仅考虑dp对理论塔板高度H的影响,Van Deemter方程可简化为如下方程:
其中:dp为固定相粒径,μm;a、b、c分别是涡流扩散系数、分子径向扩散系数、传质因子;v为流动相的平均线速度,m L/min。
 
由式(2)可见,在相同线速度下,填料粒径越小,理论塔板高度越小,柱效越高。
1.1 有机和无机杂化颗粒填料
 
有机-无机复合基质填料是由无机材料表面包覆有机聚合物构成,无机材料经过聚合物包覆后,其表面可以很好的被屏蔽,从而避免了无机材料与溶质的相互作用,同时包覆的聚合物又可以发挥其耐酸碱的特性,因此有机-无机复合型填料结合了无机材料的高效性,优良的机械强度以及有机材料的化学稳定性等优势于一身。杂化颗粒技术在高效液相色谱时期已开始使用,第二代的杂化技术被用在了UPLC上,它使用双(三乙氧基硅)乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团,如此键合出来的二氧化硅微球内部具有更多的类交联的介孔结构大大增加其机械强度[6]。杂化颗粒技术使得填料表面的化学稳定性好,耐酸碱的范围宽,p H值范围在1~12;颗粒尺寸(约1.7μm)控制也赋予了其优越的分离性能。
 
在应用方面,最早商业化的UPLC色谱柱是Waters公司的1.7μm ACQUITY UPLCBEH C18柱和1.8μm ACQUITY UPLCHSS C18柱[6],其物性指标对比见表1。
表1 1.7μm BEH C18柱和1.8μm HSS C18柱主要物性指标
 
*:未查到20 nm孔径下的其他物性指标。
 
表1中1.7μm ACQUITY UPLCBEH C18柱孔径有13 nm、20 nm和30 nm,可满足不同样品的分析要求。13 nm孔径的色谱柱的6种不同的键合相,均可用于小分子化合物的分析,其中HILIC/Amide都是基于亲水相互作用的色谱机理,并专门用于强极性化合物,如糖、有机酸或极性碱的分析;20 nm孔径的SEC分子排阻色谱柱用于生物药物,如抗体、重组蛋白等的聚合物杂质分析;30 nm孔径的色谱柱的2种键合相,均可以用于大分子的分析。HSS C18柱是全封端的超高效通用型的色谱柱,可以为碱性化合物分析提供良好的峰形,比BEH C18柱具有更强的保留能力,在酸性流动相条件下具有超长使用寿命[7]。
1.2 核壳型颗粒填料
 
用于UPLC的核壳型颗粒填料是采用溶胶-凝胶处理技术与纳米结构技术的结合产生的结构材料,在坚实的硅胶核心表面生成了一个既坚固稳定又分布均匀的多孔外壳,使填料的表面积大大增加,有研究证明,1.7μm核壳型颗粒的色谱柱,其分离效率达到350 000 plates/m(每米的板数),壳的厚度对效率和保留能力有显著的影响[8]。Sanchez等人[9]曾用1.3μm的核壳结构的色谱柱填料填装出50 mm×2.1 mm色谱柱,经考察其柱效率已可达425 000~510 000 plates/m。但是,经试验发现,它的磁导率比1.7μm核壳型颗粒的色谱柱低45%,导致同等尺寸色谱柱、同样色谱条件下,1.3μm的柱压增大1倍,因此,一味的追求小尺寸并不能达到理想的效果。
 
这一类型的色谱柱除美国Waters公司有产品外,其他公司也进行了攻关研制,如美国Phenomenex公司的核壳型Kinetex色谱柱;美国Advanced Materials Technology公司的Halo HPLC色谱柱;日本Chroma Nik Technologies公司Coreshell C18 (3.0 mm×150 mm,2.6μm,)等[10]。这几种色谱柱也都能达到耐高流动相压力,且分离速度快,还有一个特点是耐污染能力强。
1.3 微球粒填料
 
多孔聚合物微球是指采用聚合方法制备出的具有多孔结构的聚合物球形颗粒,其可控的孔结构而具有特殊的尺寸效应和界面效应[11]。二氧化硅微球因其化学稳定性好、机械强度高、粒径分布窄等特点而成为开发最早应用最广泛的色谱柱无机基质固定相。而二氧化硅微球的粒径的大小,单分散性的优良与否,尤其是其功能化改性的好坏等性质可以直接影响到色谱柱的分离性能。因此,制备粒径适宜、单分散性良好的二氧化硅微球以及开发高效稳定的功能化改性新方法一直是色谱领域研究的热点。为了达到提高分离效率和改善分离性能,微球表面通常要进行各种官能团的功能化改性,常用的改性官能团有十八烷基、辛基、苯基、氨基、氰基等。传统的St9ber法利用硅醇盐,如原硅酸四乙酯(TEOS)在碱性催化剂的条件下进行快速的水解缩合反应,形成二氧化硅微球,但是得到的硅球粒径一般小于1μm,且因反应时间长也可能会导致种子粒子聚集和二次粒子的生成,从而导致多分散粒子并将影响其材料的性质。Yu B[12]等采用改进的St9ber法制备二氧化硅微球,研究了TEOS的添加速度、氨水的浓度以及反应的温度对微球粒径的影响,成功的制备出单分散性良好、粒径在1~2μm的无孔二氧化硅微球,并对其进行表面的修饰后用作UPLC色谱柱填料,对C60和C70实现了基线分离。利用溶胶-凝胶法也可合成多种材料种类的微球颗粒柱填料,如微颗粒二氧化钛等。但是,这类填料仍未商业化,需要继续研发。
1.4 整体柱技术
 
整体柱作为一种新型的色谱柱,被誉为是继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第4代分离介质[13],是色谱柱设计开发上唯一真正原始性的创新,著名分离科学家Guiochon[14]也认为整体柱将成为未来色谱分离的主要工具。这种色谱柱的整体介质结构具有通透性高、多孔结构和大比表面积等优点,使分离分析可达到高效快速、高通量、低背压等要求。特别是硅胶整体柱,其机械强度好、比表面积大、具有双孔结构、孔隙率大于80%,其结构接近灌流色谱填料,很适合高通量分析和快速分离。通孔的存在使得硅胶整体柱具有优异的渗透性,而中孔的孔径又决定了分离度和柱效。
 
另外,整体柱较易修饰,具有像环糊精、纤维素衍生物、蛋白质、大环抗体等修饰的高选择性、高效的手性,并且,整体柱串联后在高流速下使用,可取得比短柱更好的分离度。由于表面积大,修饰时衍生配体的键合量高,在高效亲和色谱中的应用也受到人们的关注,产生了亲和整体柱色谱法[15]。
2 色谱柱的商业化
 
美国Waters公司是首先研制出高效液相色谱柱并推出商业化产品ACQUITY UPLC的公司。最早创造出的2种基体的高效耐压UPLC颗粒:1.7μm BEH颗粒和1.8μm HSS颗粒[14]。1.7μm BEH颗粒色谱柱有几个特点:(1)具有较宽的p H值范围(p H值为1~12),能够帮助使用者快速有效的开发方法;(2)使色谱柱具有更低的次级相互作用,峰形更好、柱效更高;(3)有13 nm、20 nm和30 nm这3种孔径的尺寸类型,分别针对分离不同相对分子质量段有机物。HSS C18之后又推出了HSS C18 SB(Selectivityfor Bases)和HSS T3等高强度硅胶颗粒柱。2013年,公司再次推出1.6μm实心颗粒超高效液相CORTEC-STM C18色谱柱,且CORTECS C18色谱柱是一款通用型高效反相色谱柱,在中、低p H值范围内可实现稳定的酸、碱和中性化合物保留性能;而CORTECS C18+色谱柱是一款表面带正电荷的通用型反相色谱柱,在低p H值条件下用于碱性化合物分析时可获得出色的峰形。目前,公司提供给市场的色谱柱有百余款。
 
美国Agilent公司也开发出了1.8μm的小颗粒填料,且新近推出了Agilent 1290 Infinity系列高分离度快速液相色谱系统[15],采用的是第二代ZORBAX快速分离高通量色谱柱。ZORBAX色谱柱是全多孔填料颗粒柱,载样量和分离度较高,主要用于反向液相色谱分离。
 
日本岛津公司在开发超高效液相色谱和色谱柱技术方面也有进展,其超高效液相色谱柱采用的是均一的2.2μm粒径填料,通过对流动相加温(加温有利于降低流动相黏度,并使操作压力下降)、提高流速来缩短分析时间和提高柱效[15]。
 
美国Phenomenex公司开发的核壳型色谱柱Kinetex并不完全多孔。原因是其结合应用了溶胶-凝胶处理技术与纳米结构技术,在坚实的硅胶核心上生成了1个既坚稳又均匀的多孔外壳,且几乎没有硅醇活性。
3 UPLC应用实例及问题
3.1 UPLC应用实例
 
(1)安徽古井贡酒股份有限公司[17]采用美国Waters公司Acquity超高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、Empower工作站,色谱柱选用Waters UPLC C18柱,建立了1种超高效液相色谱测定白酒中琥珀酸含量的方法,结果见图1。
 
从图1的色谱看,样品在3 min之内所有成分都已分离流出。经计算,其线性相关系数R2=0.999,精密度为1.17%,测试精准、快捷。
图1 酒样品中琥珀酸的UPLC图谱
 
 
(2)高明等[18]同样采用Agilent 1260超高效液相色谱仪,选用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×100 mm,1.8μm),流动相为V(乙腈):V(p H值为4.0的12.5 mmol/L磷酸二氢钠)=40∶60的混合溶液,对橡胶轮胎料中的6种助剂(防老剂、防焦剂、硫化促进剂等)进行测量,采用外标法可快速、精确的检定助剂的含量;支红峰等[19]采用美国Waters公司UPLC I-class超高效液相色谱仪、选用岛津Shim-pack XR-ODSⅡ色谱柱,建立了绿茶中茶氨酸、没食子酸、可可碱、咖啡因、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素以及没食子儿茶素的超高效液相色谱检测方法。试验方法简单、检测周期短、灵敏度高、分离效果理想,可准确定量检测绿茶中的10种活性成分;佟芳荻等[20]用美国Waters公司H-Class超高效液相色谱仪、CORTECS UPLC C18色谱柱(2.1 mm×100mm,1.6μm),对市售的果汁、面包和蜜饯食品进行处理和检测,将4种防腐剂和5种甜味剂的混合标准中间溶液稀释成浓度为10.0 mg/L的混合标准工作溶液,分别以0.02 mol/L乙酸铵和0.02mol/L乙酸铵+质量分数为0.02%的乙酸不同体积比作为流动相进行洗脱。在洗脱梯度相同条件下,考察不同流动相对目标物的分离效果的影响。通过优化数据采集模式、降低极限漂移带来的干扰,缩短了检测时间,并提高了检测精度。
3.2 存在的问题
 
UPLC目前存在的不足之处主要体现在:(1)价格较贵。由于对泵压、系统的耐受性、检测器的灵敏度等的特殊要求,使得UPLC本身的造价提高。因此,造成一些预算不足的单位购买力降低;(2)由于色谱柱填料的颗粒尺寸较小,允许通过的样品组分的颗粒尺寸也相应变小。所以,堵塞色谱柱的现象会比HPLC的频次增多;(3)色谱柱专用。UPLC不能和传统的HPLC色谱柱通用,且专用柱造价高,因此影响了它的市场占用率。
4 展望
 
(1)由于UPLC能显著提高色谱分离度、提高分析效率、节省溶剂消耗,同时提供智能化的分析,确保分析数据的可靠性和高效率。因此,UP-LC是目前包括石油化工在内的多个行业的主要分析手段,其应用将会越来越多。
 
(2)建议在提高色谱柱的普适性、延伸色谱柱的应用范围上取得更大进展。如对于一些极性差别较大、组成较为复杂的化工产品的快速分离,目前的色谱柱还存在一定的难度。因此,色谱柱填料的多元化是完善这一思路的方向之一,也是化工行业从业者期待的产品。
 
(3)随着UPLC未来的发展,以前无法分析的复杂样品也有了希望,也因此出现了越来越多的联用技术,如二维UPLC,UPLC-质谱联用等,为科研和生产提供更深度的分析工具。
 
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