高效液相色谱法 (HPLC) 已成为药物分析, 特别是多组分分析和杂质控制中最重要、最广泛的分析技术之一[1,2,3,4,5]。伴随着理论体系不断完善, 分离方法不断更新, 仪器性能不断改进, 应用领域不断扩展, 液相色谱分析技术已经、正在和必将继续飞速发展。就技术领域发展而言, 主要包括仪器性能、数据处理以及色谱柱技术等方面的提高和改进。如今, 色谱柱技术的不断改进创新, 填料种类的日益丰富, 分离模式和分离方法的逐步完善, 为分离分析科学描绘了一幅幅绚丽的图景。由于色谱柱是液相色谱分离的核心, 开发新型或高性能的高效液相色谱填料 (又称为填充剂、固定相) , 提供多种色谱柱类型一直是色谱研究中最丰富、最有活力、最富于创造性的内容。本文将主要讨论液相色谱柱及其填料的进展分类, 以及在药品标准、特别是在药典中的应用现状。
1 液相色谱柱及其填料种类
改善分离度和色谱峰形一直是分析工作者关注的主要问题, 通过改变流动相组成来提高色谱柱的选择性是分析工作中常用的手段。不过, 由于改变流动相如有机相比例、p H、缓冲盐浓度等以提高色谱柱的选择性或分离能力有限, 为适应日益增加的分离要求, 开发选择性更高、性能更优越的色谱柱就成为液相色谱法的研究热点之一[6]。如今, 为适应分离工作数量和难度的需求, 越来越多的色谱固定相被开发出来, 并不断地被应用于实际分析包括药物分析工作中。色谱柱填料的基质、形状、尺寸、类型、直径、孔径、比表面积等因素将影响色谱柱的性能。为便于理解, 下文按不同的方式对色谱柱或填料进行分类。
1.1 按色谱填料种类不同分类
按基质材料化学组成的不同, 液相色谱填料主要分为两大类:有机基质填料和无机基质填料。无机基质填料是研究和应用的主流, 其中应用最多的材料是硅胶, 其具有机械强度高, 比表面积大及表面易于修饰等特点, 是开发最早, 研究最为深入, 应用最为广泛的液相色谱填料, 其应用占液相色谱填料的90%以上[7,8]。硅胶表面覆盖着强极性的硅醇基, 在非极性流动相中与样品分子发生作用, 也可以作为化学键合相的反应位点。因此, 硅胶、键合硅胶是正反相液相色谱法中最常用的色谱柱填充剂。
最初使用的硅胶填料是无定形微粒硅胶, 无定形硅胶易于制备, 价格低廉, 但涡流扩散大, 渗透性差, 柱效不高, 重现性较差。20世纪70年代, 科克兰 (J.J.Kirkland) 采用硅珠堆砌技术制备全多孔球形ZORBAX硅胶, 该填料平均粒径约7μm, 具有更好的渗透性、比表面积和更高的柱效, 而且球形填料易于填装, 重现性好。到1995年, 在分析色谱中不定型填料基本被5~10μm的球形颗粒填料取代, 前者因为价格便宜, 主要是用于制备色谱分离;现在的分析色谱中, 球形颗粒硅胶基质的色谱填料已经占绝对地位。
硅胶基质分为A型硅胶和B型硅胶:A型硅胶金属含量较高, 导致硅胶纯度较低, 且酸性较强, 从而导致色谱峰拖尾和某些化合物回收率很差;B型硅胶是通过全合成获得的填料, 称之为高纯硅胶, 可有效地控制金属离子的含量 (一般控制在0.05%以内) , 避免活性化合物在色谱柱上与金属离子产生螯合, 也降低了硅醇基的活性, 有利于避免碱性化合物拖尾。另外, 为了提高硅胶基质的稳定性, 在硅胶表面进行有机改性, 如聚合物包覆, 或引入有机杂化基团, 可以使基质填料表面的部分硅羟基被有机基团代替, 从而提高p H耐受性, 也能降低碱性化合物的拖尾[9]。
有机基质填料主要分为多糖型和聚合物型两大类, 前者是以天然多糖化合物为原料, 用物理方法加工成微球并经过交联而得到的凝胶, 如葡聚糖、琼脂糖等基质的凝胶, 主要用于凝胶渗透色谱 (GPC) 。后者以合成单体与交联剂为原料, 用化学聚合方法制备的交联高聚物微球, 如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物以及聚甲基丙烯酸酯类树脂等, 有机聚合物填料排除了硅醇基的影响, 具有较强的色谱容量, 不容易产生不可逆的非特异性吸附, 有较好的化学稳定性[10]。
1.2 按键合相种类不同分类
中国药典 (0512高效液相色谱法) 按键合相种类不同分类如下[11]:
反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等;常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶 (C18) 、辛烷基硅烷键合硅胶 (C8) 和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱:用硅胶填充剂或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等, 在使用正相体系时, 一般都采用弱极性的溶剂作为流动相。此类极性固定相如硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等也可使用含水的流动相, 此时化合物的保留随着流动相中水的比例增加而减弱, 这种分离模式称为亲水作用液相色谱 (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) 。
离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性拆分色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。
在中国药典分类所述的各类色谱柱中, 反相色谱柱是应用最广泛、最常见的一种。
1.3 按色谱柱填料粒径大小分类
根据色谱填料粒径的大小, 色谱柱可分为常规色谱柱、亚2微米填料色谱柱和大粒径色谱柱。常规的色谱柱内径一般为3.9~4.6 mm, 填充剂粒径为3~10μm。限于仪器系统、载样量、柱效、分离度等因素的影响, 5μm粒径, 4.6 mm×250 mm尺寸的色谱柱依然是常规液相分析中最广泛的色谱柱尺寸。但在常规液相体系中使用3μm或3.5μm的填料时, 可在获得较快分析速度的同时, 节省溶剂, 故又称溶剂节省柱。
亚2微米填料色谱柱通常填充1.3~2.0μm的颗粒填料, 色谱柱内径一般为2.1~3.0 mm, 长度一般为30~150 mm。由于这样的色谱柱填料粒径小, 在液相系统中会产生极高的反压, 压力通常大于40 MPa, 故需要在更高的超高压 (或超高效) 液相色谱系统中使用。
大粒径色谱柱 (粒径大于10μm) 现主要用于制备色谱分离纯化, 即制备色谱柱;或者用于大分子物质分析如凝胶渗透色谱或体积排阻色谱 (GPC/SEC) 。用于大分子物质, 如聚合物、蛋白、单抗等分析时, 一般相对分子质量都大于2 000, 采用的色谱填料孔径应大于300。
1.4 按色谱柱填料结构类型分类
在色谱分离过程中, 溶质分子与固定相间的传质速率通常被其在色谱柱填料中的扩散所左右。颗粒形状和大小, 孔的结构、孔径及其分布等与比表面积有关。按照色谱填料孔结构类型主要有无孔型、全多孔型和表面多孔型。
无孔型的填料表面无孔, 消除了溶质在孔内较慢地扩散传质引起的谱带展宽效应, 可提高柱效, 但由于其比表面积非常小, 载样量也很小, 故应用不多。一般使用非常细的填料 (1~1.5μm) , 填充于较长的色谱管柱中, 用于大分子物质分析。
全多孔型填料是在硅胶制备过程中形成的多孔硅胶, 多孔体系的形成有利于提高溶质在固定相中的分配和保留, 具有柱容量大和选择范围宽等优点。全多孔型填料又分为颗粒型 (particles) 和整体化色谱柱 (monolithic column) , 其中全多孔型填料颗粒 (total porous particles) 是目前使用最多的液相色谱固定相材料。
表面多孔型填料是在无孔实心的硅胶核外面生成一个均匀的多孔外壳。由于颗粒内核是实心的, 溶质成分在通过固定相时, 只在颗粒填料表面的多孔成分进行吸附和分配, 其扩散路径缩短, 传质效率提高, 只需要花费少量的时间便能扩散至硅球表面的颗粒孔中, 在较短时间完成扩散, 更快地传质。与相同粒径的全多孔型填料相比, 其传质速度和柱效得到大大提高[12]。全多孔颗粒填料和核壳型填料的颗粒构造如图1所示。
图1 全多孔颗粒填料与表面多孔壳填料比较示意图Fig.1 The diagrams of totally porous particle packing and superficially porous particle packing
2 液相色谱填料技术进展
近年来, 液相色谱填料技术的发展主要在于快速液相色谱分析、多种色谱固定相及各种分离模式的应用。
2.1 基于亚2微米填料的高效液相色谱柱技术
范氏 (Van Demeter) 方程是一个描述线速度与塔板高度 (柱效) 关系的经验式。在范氏方程中, 填料粒径大小是影响塔板高度的变量之一 (图2) [13], 因此, 提高分离效能的有效方法之一是减小填粒粒径。较小粒径的填料有利于降低涡流扩散及改变传质路径, 不仅使柱效更高, 而且即使在较高的线速度下, 理论塔板高度也不会增大, 使色谱柱的分离性能得以保持, 并有效地缩短分析时间和减少溶剂消耗, 更加绿色环保[14]。2000年前, 人们专注于键合相类型的开发。2003年, 在匹兹堡展会 (Pittcon 2003) 上展出了1.8μm的ZORBAX STM (亚2微米, SB-C18柱) 快速分析色谱柱[15], 该色谱柱柱效是常规3.5μm色谱柱的2倍, 开启了液相色谱更高效快速分析的新篇章。同时, 耐压能力达60 MPa甚至120 MPa的超高效液相色谱仪的逐步推出, 使得采用小粒径色谱柱, 通过提高流速加快分析速度, 能有效提高分辨率和灵敏度, 从而使得诸多复杂体系的分离成为可能。如今, 以亚2微米填料为填充剂的高效液相色谱柱 (粒径1.6~2μm) 正在得到更广泛的应用, 例如, 使用1.8μm的C18色谱柱分析《中国药典》2015年版一部中的复方丹参滴丸指纹图谱[16], 其时间可以控制在10 min以内, 见图3。
图2 理论塔板高度与色谱柱粒径的关系Fig.2 The relationship of theoretical plate height and the particle size of column
图3 中国药典一部中复方丹参滴丸的高效液相色谱分析图谱Fig.3 HPLC chromatogram of Danshen dropping pills in Chinese Pharmacopoeia Vol.Ⅰ
色谱柱 (column) :ORBAX XDB C18 (2.1 mm×100 mm, 1.8μm)
中国药典对亚2微米色谱柱技术革新和应用给予高度的关注, 适时地修订了液相色谱法的相关内容。中国药典2015年版四部通则0512色谱法规定[11], 若需使用小粒径 (约2μm) 填充剂, 输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要, 色谱条件也应作适当的调整。当对其测定结果产生争议时, 应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
2.2 表面多孔型填料技术
表面多孔型颗粒填料 (superficially porous particles, SPPs) 又称核-壳型填料 (core shell particles) , 商品化的产品有5μm的Poroshell 300 SB C18, 该填料采用4.5μm的硅胶实心内核, 外面包裹一层0.25μm的多孔层, 平均孔径为300, 主要用于蛋白质和单抗的快速分析。由于表面多孔型填料具有极窄的粒径分布和扩散路径, 同时可以减小涡流扩散, 缩短传质路径和减弱传质阻力, 即便使用较粗的填料颗粒也可获得较高的柱效。目前, 一般使用亚3μm的表面多孔型填料 (2.6~2.7μm) , 即可获得亚2微米填料的柱效。这种颗粒一般采用1.7μm的实心核, 外部为0.5μm厚度的全多孔层, 它们具有亚2微米全多孔填料色谱柱相当的柱效, 而其柱压仅为亚2微米全多孔填料的一半, 见图2中色谱柱柱效与颗粒粒径的关系。此类色谱柱一般操作压力在20 MPa左右, 故可以在耐压40 MPa的普通液相色谱系统上运行, 使得普通液相色谱仪实现高效快速分析成为现实。这种填料在过去5年里是液相色谱领域发展最快的一种填料类型[17,18], 发展非常迅速, 2010年时只有3家色谱厂商提供2.7μm粒径的表面多孔型填料用于小分子化合物分析, 2015年底则发展到了16家, 键合相的类型超过了12种, 填料的粒径扩展为1.3、1.6、2.6、2.7、4和5μm, 而生产用于大分子化合物分离的大孔径表面多孔型填料的厂商也增加到了9家。
由于柱压与填料粒径的平方成反比, 如图4所示, 在完成同一组化合物的快速分离时, 相同柱尺寸条件下, 2.7μm表面多孔填料色谱柱的柱效与1.8μm全多孔填料相当, 而压力仅为亚2微米填料的一半, 这使得2.7μm的表面多孔型填料可以在普通高效液相色谱仪上实现超高效液相色谱的分析效率。故在近年的国际学术会议, 包括2015年12月北京色谱年会上, 讨论最多的话题也是表面多孔型填料。Ron Major统计, 在Pittcon 2014上, 关于SPP的话题数量比亚2微米填料的10倍还多。
图4 亚2微米全多孔填料与亚3μm表面多孔填料色谱柱分离结果和参数比较Fig.4 The chromatography results and parameters separated with 2microns full porous packing column or with 3 microns surface porous shell packing column
流速 (flow rate) :0.582 m L·min-1;流动相 (mobile phase) :乙腈-水 (acetonitrile-water) (60∶40) ;进样量 (injection volume) :4μL;柱温 (column oven) :26℃
2.3 整体化色谱柱填料技术
整体化色谱柱 (monolithic column) 也是近年液相色谱柱填料研究的另一个重要方向。整体柱, 又称为棒状柱, 是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。与常规装填的液相色谱柱相比, 整体柱具有更好的多孔性和渗透性, 可以使用高流速实现快速的传质分离。聚合物整体柱一般采用离子交换或亲和色谱方式, 用于生物大分子如蛋白、抗体、DNA的超快速分析, 这样的色谱柱包括Bio-Monolith离子交换柱和Protein A、Protein G亲和色谱柱, 以及Thermoro Swift IEX离子交换柱和Pro Swift RP柱。使用此类整体化色谱柱分析大分子物质时, 分离通常可以在几分钟内完成。无机基质的整体柱一般采用硅胶以及在硅胶表面键合的反相填料, 柱床中既有供流动相流过的粗孔 (约2μm) , 又有便于溶质进行传质的中孔 (几十个纳米) , 如图5 (来源于Merck的目录资料) 所示。市场上商品化的整体柱产品不多, 如Chromolith®整体柱, 该柱子具有非常低的柱压和较高的基质耐受能力, 因此在普通高效液相色谱仪以及超高效液相色谱仪上都可以兼容。由于粗孔的存在, 流动相流过整体化柱床时的压力非常低, 这有利于提高流速来获得快速分析的结果, 即使在9 m L·min-1的流速条件下, 最高压力也不会超过20 MPa。
图5 整体化色谱柱Chromolith®的表面电镜放大图Fig.5 The enlarged electron microscope of the holistic chromatogr-aphy column Chromolith®
2.4 不同选择性的色谱固定相
由于反相色谱分离基于多种作用力的结果, 不同键合相或同一种键合相但不同的硅胶基质、封端技术和键合技术, 其疏水作用、空间位阻、氢键作用、静电作用、π-π作用、偶极-偶极作用等能力不同, 对化合物的分离能力不同, 故而表现出不一样的选择性[13]。比如, 在碳链中嵌入极性的酰胺基团, 不仅能够使键合相的水相兼容性增加, 而且可以提高化合物与固定相之间的氢键作用能力, 使之获得与普通C18填料不一样的选择性。这样的色谱柱有ZORBAX Bonus RP和Waters Symmetry shield等。Huawei Gu等[19]利用Bonus RP色谱柱与其他常规碳链反相色谱柱选择性的不同, 使用二维液相色谱实现复杂体系的分离。又如, 苯基柱可以提供π-π作用, 用于含有苯环或能提供π键作用的结构类似物分析;而五氟苯基 (Penta Fluorophenyl Propyl, PFP) 柱 (则除了提供π-π作用外, 还可以提供偶极作用、静电作用等, 提高了苯环上位置异构体的分辨能力。
一般硅胶基质填料的固定相其p H适用范围为2~8。为提高硅胶基质的填料键合相在酸性条件下的稳定性, 一般在碳链的硅烷基侧链上采用大体积的有机基团进行保护, 比如采用双异丁基或双异丙基的侧链保护, 使得此类色谱填料能够稳定地用于p H0.8~8的流动相体系中, 而不会导致硅烷键的流失。如中国药典方法中, 洛伐他汀、氢溴酸右美沙芬等在较低p H条件下, 使用这类的色谱柱可以获得较好的耐用性。
在提高硅胶基质填料碱性稳定性方面, 除了使用致密键合、双配位键合以及双重封端等技术, 还使用硅胶-有机杂化颗粒, 或者在硅胶表面进行聚合物包覆, 提高硅胶在碱性条下的稳定性, 同时降低硅醇基在碱性条件下的解离, 避免碱性化合物拖尾。近期推出能够耐受高p H稳定性的Poroshell HPH-C18 (2.7μm) 和C8填料 (4μm) , 这种填料兼顾了表面多孔型填料和硅胶表面有机杂化的优势, 具有高柱效、宽p H耐受范围 (2~11) 的优势[20,21]。
2.5 多种分离模式的应用
目前液相色谱中主要应用的依然是反相色谱, 不过随着色谱技术的发展和分析要求的提高, 其他一些分离模式正逐步得到更加广泛的应用, 如亲水作用色谱 (HILIC) 、超临界流体色谱 (supercritical fluid chromatography, SFC) 、临界点色谱 (liquid chromatography at critical condition, LCCC) 和多维色谱技术等。
HILIC是近年来逐渐被认可的一种强极性化合物分离方法, 它是基于极性化合物在色谱固定相表面水层和流动相之间进行的亲水分配作用达到保留的一种分离模式。在HILIC分离中, 流动相中水的比例越小, 则洗脱能力越弱;反之, 洗脱能力越强。化合物的极性越小, 则保留越弱;反之, 则保留越强。HILIC模式可以跟任何检测器兼容, 并能提高质谱的灵敏度, 避免使用离子对试剂, 避免进行衍生化, 是极性化合物分析最有潜力的分离模式。HILIC模式一般采用高纯硅胶、硅胶表面键合二醇基、酰胺、两性离子基团等基团或极性聚合物等为固定相, 而采用高比例的有机相为流动相[22]。
SFC是以超临界流体作为流动相的一种色谱技术, 该技术具有高效、快速、操作条件易于变换等特点, 非常适合于手性药物的分离[23]。几乎所有的液相色谱柱都可以用于SFC, 常用的有硅胶柱 (SIL) 、氨基柱 (NH2) 、氰基柱 (CN) 、2-乙基吡啶柱 (2-EP) 等以及各种手性色谱柱, 某些应用也会使用C18、C8等反相色谱柱和各种毛细管色谱柱。
LCCC法是根据聚合物的功能基团、嵌段结构的差异进行聚合物分离的一种色谱技术。LCCC法的原理是基于临界点之上、临界点之下以及临界点附近的标度理论。当使用多孔填充材料作为固定相时, 分子排阻色谱 (size exclusion chromatography, SEC) 和相互作用色谱 (interaction chromatography, IC) 的分离机制在分离聚合物时同时发生作用。在某个特殊色谱条件 (固定相、流动相组成、温度) 下, 存在2种分离机制的临界点, 被称为焓熵互补点或色谱临界条件 (critical conditions) 或临界吸附点 (critical adsorption point, CAP) 。在这一点, 聚合物分子按照分子末端功能基团的不同或嵌段结构的差异分离, 与分子的聚合物摩尔质量 (分子量) 无关, 聚合物的洗脱体积等于色谱柱的空隙体积。目前, 这一技术成功用于脂溶性聚合物的分析[24], 对于水溶性聚合物的应用研究有待深入和扩展。为适应大分子量聚合物的分离需要, 比常规孔径、粒径大得多的填料和更宽柱径的色谱柱也应随之出现。
另外, 当样品组分非常复杂时, 使用一种分离模式进行分离变得非常困难, 多维色谱应运而生。多维色谱又称为色谱/色谱联用技术, 是采用匹配的接口将不同分离性能或特点的色谱连接起来, 第1级色谱中未分离开或需要分离富集的组分由接口转移到第2级色谱中, 第2级色谱仍需进一步分离或分离富集的组分, 也可以继续通过接口转移到第3级色谱中。实际上, 一般选用2个合适的色谱联用就可以满足对绝大多数难分离混合物样品的分离或富集要求。因此, 通常的色谱/色谱联用都是指二维色谱。
若2种色谱的联用仅是通过接口将前一级色谱中某一 (些) 组分传递到后一级色谱中继续分离, 这是中心切割式二维色谱 (heart-cutting mode twodimensional chromatography) , 一般用C+C表示。但当2种色谱联用, 接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离, 这种二维色谱称为全二维色谱 (comprehensive two-dimensional chromatography) , 一般用C×C表示。C+C或C×C 2种二维色谱可以是相同的分离模式和类型, 也可以是不同的分离模式和类型。接口技术是实现二维色谱分离的关键之一, 原则上, 只要有匹配的接口, 任何模式和类型的色谱都可以联用。
常见的二维液相色谱 (2D-LC) 是将分离机制不同而又相互独立的2支色谱柱串联起来构成的分离系统, 通过柱切换技术实现样品在一维和二维色谱柱之间的流动。例如, 将2D-LC应用于复杂基质的中药材及中药复方制剂的分析, 可显著提高色谱柱的峰容量和色谱峰鉴定的可靠性, 降低色谱峰重叠, 使分离效率与分析通量大大提高[25,26]。通常会将反相/反相、正相/反相、离子交换/反相和手性/非手性等形成正交关系的色谱柱用于2D-LC分离。使用反相/反相模式进行二维色谱分离时, 使用不同p H或缓冲盐可以获得正交的分析结果。
因此, 广大色谱工作者面临的问题是:如何选择合适的色谱柱以满足各种分析的要求, 如何利用现有设备发挥更快的分析效率, 如何利用不同色谱柱选择性的差异获得更好的选择性、分离度和柱效。
3 液相色谱柱在药典标准中的应用情况分析
新颁布的2015年版《中国药典》自2015年12月1日起正式实施。新版药典的最大变化是将原来各部的附录整合成了第四部, 形成通则并对通则制定了更为合理的编码, 液相色谱法列于2015年版《中国药典》 (四部) 中通则0512中。
3.1《中国药典》中使用的各类色谱柱
液相色谱方法在新版《中国药典》中得到了更广泛的应用, 使用方法也更加合理。以二部化药为例, 在修订的415个品种中, 有的新增了液相色谱检测方法, 如本芴醇在有关物质检查项下, 采用液相色谱法取代原来的薄层色谱法, 规定杂质Ⅰ与主成分的分离度, 以及杂质峰面积等要求, 并列出了杂质Ⅰ的结构信息, 这不仅使杂质的信息更加明确, 而且对杂质限量的控制更加准确;有的对流动相进行了修订, 如叶酸的含量检测中, 通过添加离子对试剂―四丁基氢氧化铵, 增加了叶酸的保留, 流动相中甲醇的比例也从原来的每升80 m L增加到270 m L, 这样有利于防止色谱柱C18键合相在高水相比例下产生疏水塌陷。
但是, 与液相色谱柱和填料种类的快速发展相比, 在中国药品标准中, 包括在《中国药典》中, 高效液相色谱柱的应用显得较为单调, 缺乏活力。表1、表2分别列出2015年版和2010年版《中国药典》一部和二部使用液相色谱柱的情况。
表1 2015年版和2010年版中国药典一部中液相色谱柱的使用情况Tab.1 The list of the liquid chromatographic column usages in Ch P Vol.Ⅰof 2015 ed.and 2010 ed.
表2 2015年版和2010年版《中国药典》二部中色谱柱的使用情况Tab.2 The list of the liquid chromatographic column usages in Ch P Vol.Ⅱof 2015 ed.and 2010 ed.
由表2可以看出, 在各类药品分析中, 绝大部分方法采用的是反相液相色谱法, 色谱柱则是以C18柱为主;与2010年版相比, 2015年版《中国药典》中C8柱的使用数量翻了1倍;而其他各种类的液相色谱柱使用比例则较少。
3.2 各国药典对液相色谱柱规定
3.2.1 关于色谱柱类型描述的差异
美国药典对色谱柱分类则较为详细, 收载的各类液相色谱固定相 (柱) 类型已经超过80种, 除C18柱、C8柱、氰基柱、氨基柱、苯基柱外, 还有C6柱、C4柱、C1柱、五氟苯基 (PFP) 柱等。根据是否化学改性, 是否封端, 是否增加多官能基团以及是核壳结构还是多孔型结构等不同, 以C18为基质的色谱柱分类为L1、L2、L42和L67等, 以C8为基质的色谱柱分别有L7、L28、L42和L44等。L1柱对应于目前使用的各种C18分析柱, L2柱常作为保护柱使用。由此可知, 美国药典提供的可选择的色谱柱比较丰富。
不过, 尽管各厂家或品牌C18在分离效果上存在一定差异, 美国药典却没有对各种商品化C18再进一步细分。
在英国药典中, 当用到特定色谱柱时, 色谱柱信息描述会具体到色谱键合相类型、尺寸、键合相官能团描述、是否封端、是否通过碱性脱活处理等。
和欧美药典相比, 《中国药典》对液相色谱法的色谱柱描述过于简单粗放, 色谱柱的种类明显偏少。方法中仅描述色谱柱填料种类的主要大类:如十八烷基硅烷键合硅胶 (C18柱) 、辛烷基硅烷键合硅胶 (C8柱) , 氰基硅烷键合硅胶 (氰基柱) 、氨基硅烷键合硅胶 (氨基柱) , 苯基硅烷键合硅胶 (苯基柱) 等。使用者无法根据不同性质的化合物选择适合分离的色谱柱。
为解决这一矛盾, 满足某些特殊分析目的, 或为了简化色谱柱选择的过程, 新版药典在某些品种的标准正文中对色谱柱给出了具体描述及品牌的信息。如在新颁布的2015年版《中国药典》新增品种拉米夫定及片剂中, 含量测定及有关物质测定项对所使用的色谱柱描述为“用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (Zorbax XDB-C18, 4.6 mm×250 mm, 5μm或效能相当的色谱柱) ”。检测人员可直接选择对应色谱柱进行检测, 避免进行盲目的大量色谱柱筛选工作。但详细列明色谱柱信息描述似乎从一个极端走到了另一个极端, 从完全的粗放转到特定的选择。在一定程度上, 这种具体至色谱柱厂家或品牌仍不是很客观的方法。因为某种色谱柱并不一定仅有1家公司生产或提供, 除非经过同类型不同厂家多根色谱柱的充分研究和实验对比, 才能规定具体的色谱柱品牌, 否则就意味着可能放弃了使用分离更好的色谱柱。
表3列举了中国药典与英美药典中几个色谱柱使用实例, 以便比较各药典对色谱柱分类及应用情况。
表3 中国药典与欧美药典中几个色谱柱使用实例的比较Tab.3 Several examples of chromatographic column used in Ch P, USP and BP
由表3可以看出, 美国药典列出了色谱柱的尺寸、填料类型编号;而英国药典不仅列出了色谱柱的尺寸和颗粒粒径, 还对固定相进行了详细的描述, 如封端的十八烷基键合硅胶, 适合高比例水为流动相的烷基键合硅胶, 碱去活封端十八烷基硅烷硅胶, 二异丙基氰基柱等。
另外, 以埃索美拉唑 (esomeprazole) 缓释胶囊为例, 表4列出在美国药典 (USP 35-NF 30) 官方网站中可以查询到分析用到的色谱柱信息。
表4 美国药典中埃索美拉唑使用的色谱柱信息Tab.4 Information of chromatographic column used for esomeprazole in USP
从表4可见, 美国药典对方法中用到的色谱柱进行了归类和详细描述, 也列出了替代的色谱柱。对于分析人员来说, 提供了色谱柱选择方面的便利性。
总之, 在中国药典中, 无论是色谱柱填料种类, 还是色谱柱填料粒径和孔径等方面的描述, 均显得较为简单、粗放, 科学性和严谨度均有待提高。
3.2.2 关于使用不同色谱柱时的方法转化
为满足系统适用性的要求, 当选择1根合适的色谱柱时, 其尺寸应在一定要求的范围内。根据待分离分析药品的特性和实际分析需要, 当使用的色谱柱填料尺寸规格发生变化时, 各国药典对色谱柱柱径和填料粒径分别有相应的限定。美国药典 (<621>CHROMATOGRAPHY) 在色谱适应性要求中对色谱柱长度、粒径、内径等变化范围作了限定。在USP 36及以前的版本中, 无论是等度还是梯度条件, 色谱柱的粒径可以减小50%, 不能增大;柱长有70%的变化选择余地, 流速也可有50%的变化范围, 色谱柱的内径以及进样量可根据情况调整。不过, 从USP 37起, 在等度条件下, 色谱柱尺寸发生变化的范围采用柱长与粒径的比值 (L/dp) 或柱效N来进行限定, 要求L/dp保持恒定, 或者N的值介于-25%~+50%之间。在梯度条件下, 则色谱柱尺寸不宜发生变化, 否则需要做方法的验证, 见表5。
表5 美国药典对色谱柱尺寸及条件变化的限定Tab.5 Restrictions of changeable chromatographic parameters in USP
中国药典虽然对色谱柱柱径和填料粒径也有相应规定, 但是仅仅区分亚2微米柱和常规柱 (中国药典现在实际上使用的几乎都是常规柱) 。某些特殊分析中, 如复杂组分、指纹图谱和有关物质的分离, 常对色谱柱有更苛刻的要求, 即使明确了色谱柱填料具体种类, 常规柱的柱内径和填料粒径范围定义太宽, 会由于色谱柱的内径和填料粒径的差异, 无法实现理想的分离和重现性的效果。
按照仪器公司商业化的概念, 采用亚2微米色谱柱的方法为超高效液相色谱法, 采用常规柱的方法为高效液相色谱法。但是, 简单地根据粒径的不同将色谱填料分为亚2微米填料与常规柱填料 (3~10μm) 并不是一种科学的分类法, 至少未能涵盖粒径为2~3μm的色谱填料柱。以美国药典要求的色谱柱粒径变化要求, 当选择粒径2.7μm的色谱住替代5μm的色谱柱时, 其变化的范围是允许的, 只要保持L/dp或N值在-25%~+50%范围内。实际上, 填料粒径对色谱分离的影响是一个量变过程, 粒径在限制性范围内改变不会引起分离机理的改变。但是, 量变到一定程度必然引起质变, 质变是量变的必然结果, 当粒径降低到一定程度时, 高效液相色谱仪到超高效液相色谱仪的质变归因于填料粒径大小降低到一定程度引起的压力突变, 进而可导致分离机理的改变和各成分峰的保留时间变化。因此, 使用常规柱填料或亚2微米填料的色谱方法转化时, 方法验证是必要的, 但是, 中国药典还没有明确规定应如何验证以及选择何参数进行验证。
尽管中国药典2015年版没有将超高效液相色谱法作为一个新方法单独收载, 并不是否认此技术革新, 而是在高效液相色谱法中作了系统的、科学的、实事求是的描述。这样既解决了概念上混乱的问题, 也是对这一技术革新在药物分析, 特别是在标准中应用的一种认同, 对这一技术在药物分析、药品检验中的广泛应用将起着一定的积极推动、引导作用。毫无疑问, 亚2微米填料以及表面多孔型填料技术将是高效液相色谱发展的一个重要方向。
3.2.3 对药典或药品标准中使用和描述色谱柱的建议
由于商品化的色谱柱填料种类、粒径尺寸、颗粒类型或选择性差异等非常丰富, 为了避免方法描述中的不确定性, 建议对中国药品标准中包括中国药典使用的色谱柱种类进行归纳总结, 国家药典委员会适时对各种可在药品中获得应用的色谱柱进行科学的归类划分, 建立相应的色谱柱列表, 以便药品标准工作者或检验人员参照使用;各色谱柱生产商或供应经销商应对归类划分工作积极密切配合, 提供必要、准确、科学、可靠的相关信息和全面的技术支持。同时, 为建立方法提供了更多的选择, 应鼓励在建立分析方法时, 药物分析工作者应大胆尝试使用各种有利于提高选择性的色谱柱, 不要仅限于常规C18柱等。
从欧美药典对固定相描述或提供的信息来看, 细化色谱柱的分类能给色谱分离分析带来积极影响:一方面, 由于可从一大类填料中选择到最适合的色谱柱用于分析, 从而可获得最佳的分离效果;另一方面, 在复杂体系分离时, 如中药成分分析或化学药有关物质测定中, 如在药品标准中明确规定了色谱填料性质参数的描述信息, 有利于克服复杂基质的干扰, 提高方法的可靠性, 或提高色谱柱的选择性。
在建立相关药品标准时, 应适当增加色谱柱尺寸如长度、内径、粒径等的描述;必要时, 在充分比对验证的前提下, 是否对使用何种色谱柱品牌予以具体规定也是可以探讨的。
为了提高色谱柱的使用寿命, 当进行一些具有复杂基质或辅料的原料药或制剂分析时, 建议尽可能地使用保护柱, 并在方法中说明。在许多品种分离分析中, 美国药典都采用了预柱, 这对保护色谱柱不受污染, 提高色谱柱寿命是极为有利的。
建议中国药典适时在相关的通则中增加对方法转化的描述, 提出方法转化的要求, 这样有利于分析人员在方法转化时有据可依。
4 结语
液相色谱柱技术的发展趋势是高效快速分离, 亚2微米填料色谱柱及亚3μm的表面多孔型填料在近年来得到了飞速的发展和应用, 各种选择性的色谱固定相和多种分离模式解决了许多分离难题。色谱柱填料类型和种类繁多, 在制定药典或相关药品标准时, 有必要细化色谱柱的分类, 从而有利于更科学、更高效地选择和利用恰当的分离技术实现药物中复杂组分的可靠分析。
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