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液相色谱仪生产厂家、液相色谱仪原理-广东科晓色谱仪器公司


      广东科晓仪器公司是一家专业研发生产销售高效液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收分光光度计等仪器和代理进口安捷伦、岛津液相色谱仪的生产厂家,提供整体实验室成套仪器设备一站式配置服务,  销售咨询电话:020-81719400,现将液相色谱仪的原理知识提供给大家参考。


第一节  高效液相色谱的特点
 
 
高效液相色谱仪法作为色谱分析法的一个分支,是在20世纪60年代末期,在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上,发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。
    20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起,而液相色谱技术仍停留在经典操作方式,其操作繁琐,分析时间很长,因而未受到重视。
    20世纪60年代以后,随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现,人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。
    因此,在20世纪60年代后,高效液相色谱技术才有了很快的发展,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)还可称为高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)或现代液相色谱(modern liquid chromatography)。

一、色谱法(chromatograph)的起源和发展
 
1.1906年由俄国植物学家Tsweet创立
        植物色素分离见图示
  2、20世纪20年代,许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离,色谱方法才被广泛的应用。
  3、30~40年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文
  4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、
       吸附色谱和电泳领域取得了成果※
  5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱※
  6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求
 
 7、70年代HPLC崛起,气相色谱和高效液相色谱,逐步成为各行各业必不可少的分析工具,广泛应用于各个生产领域。
8、1975年,美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念,在分离柱后加一个抑制柱,同年商品化的离子色谱仪问世。
9、1979年,美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪。
10、20世纪80年代以后,一种新型的色谱技术—毛细管电泳技术随之出现。
11、20世纪90 年代以后,ELSD一种新型的检测器出现,改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。
12、20世纪90  年代中期以后,用于HPLC的MS检测器开始普及,使液相进入定性的时代。
进入21世纪,HPLC在多个方面取得突破:
Merck商品化的一体化柱,给人们一种全新的色谱柱概念。
2004年,Waters提出了UPLC的新概念,超高压液相色谱。借助小颗粒的填料,特殊化的设计,实现超高效和快速、高通量的分析。
2004年10月13日,ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破,Corona™带电气溶胶检测器(CAD)诞生,新一代的通用型检测器。
2005年,岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。
HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。

二、色谱法定义、分离基础和目的
定义:利用各组分物理化学性质的不同,在流动相流    经固定相时,由于各组分在两相间的吸附、分    配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移        动,最终达到分离的目的。图例
分离基础:差速迁移   (例:赛跑)
目的:多组分分离,实现定性定量分析
液相色谱仪


三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较

从分析原理上讲,高效液相色谱法和经典液相(柱)色谱法没有本质的差别,但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经典液相(柱)色谱法使用粗粒多孔固定相,装填在大口径、长玻璃柱管内,流动相仅靠重力流经色谱柱,溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢,柱入口压力低,仅有低柱效,分析时间很长。
      高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相,装填在小口径、短不锈钢柱内,流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱,溶质在固定相的传质,扩散速度大大加快,从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。
                方法
 
项目
高效液相色谱法
经典液相色谱法
色谱柱:柱长/cm
        柱内径/mm
10~25
2~10
10~200
10-~50
固定相粒度:粒径/μm
            筛孔/目
5~50
2500~300
75~600
200~30
色谱柱入口压力/MPa
2~20
0.001~0.1
色谱柱柱效/(理论塔板数/m)
2×103~5×104
2~50
进样量/g
10-6~10-2
1~10
分析时间/h
0.05~1.0
1~20

高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高,分析速度快的特点,但它仅适于分析蒸汽压低、沸点低的样品,而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质,因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处,可对80%的有机化合物进行分离和分析,此两种方法的比较如下:不同色谱方法适用的分子量范围
方法缩写
方法全称
分子量范围
能检测的有机化合物的比重
GPC
凝胶渗透色谱
>103
80—85%
HPLC
高效液相色谱法
400--2000
GC
气相色谱法
10—400
15—20%

相同:均为高效、高速、高选择性的色谱方法,兼具分离和分析功能,均可以在线检测
 
 
分析对象及范围
流动相的选择
操作条件
GC
能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品,占有机物的20%
流动相为有限的几种“惰性”气体,只起运载作用,对组分作用小
加温常压操作
HPLC
溶解后能制成溶液的样品,高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物,占有机物的80%
流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外,还可通过溶剂来控制和改进分离。
室温、高压下进行


四、高效液相色谱法的特点

p颗粒极细(一般为10mm以下)、规则均匀的固定相,(键合相)传质阻抗小,柱效高,分离效率高;
p高压输液泵输送流动相,流速快,分析速度快;
p高灵敏度检测器,灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10-9g,而荧光检测器最小检测限可达10-12g。

与气相色谱法相比

p不受试样的挥发性和热稳定性的限制,应用范围广;
p可选用各种溶剂作为流动相,对分离的选择性有很大作用,选择性高;
p一般在室温条件下进行分离,不需要高柱温。

优点:“三高”、“一快”、“一广”

高选择性——可将性质相似的组分分开
          高效能——反复多次利用组分性质的差异
                               产生很好分离效果
       高灵敏度——10-11~10-13g,适于痕量分析
   分析速度快——几~几十分钟完成分离
                               一次 可以测多种样品
   应用范围广——气体,液体、固体物质
                              
缺点:
对未知物分析的定性专属性差
    需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
第二节  HPLC分类
p按分离机制分类:
n分配色谱法
n吸附色谱法
n离子交换色谱法
n空间排阻色谱法

基本类型色谱法的分离机制
              对于不同的分离机理,K的含义不同。
   吸附色谱                   吸附系数
  分配色谱                  分配系数
  离子交换色谱            离子交换系数        统称K
  分子排阻色谱           分子排阻系数

1.  吸附色谱(液-固吸附色谱):以固体吸附剂为固定相,如硅胶、氧化铝等,较常使用的是5~10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
2.  分配色谱(液-液分配色谱):早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,   现多为化学键合固定相,即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。

3. 离子交换色谱:固定相为离子交换树脂,流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。
4. 空间排阻色谱(凝胶色谱) 以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶;多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶;

•按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类:
–洗脱法 
–前沿法
–置换法
洗脱法(elution method)  又称淋洗法,将含有不同组分的样品注入色谱柱,流动相连续流过色谱柱,并携带样品组分在柱内向前移动,经色谱分离后,样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别,而顺序流出色谱柱。
      前沿法(frontal method)  又称迎头法,如将含三个等量组分的样品溶于流动相,组成混合物溶液,并连续注入色谱柱,由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同,则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出,其次是第二个组分与第一个组分混合流出,最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第一个组分混合一起流出。此法仅第一个组分的纯度较高,其他流出物皆为混合物,不能实现各个组分的完全分离。
      置换法(displacement method)  又称顶替法,当含有三种组分的混合物样品注入色谱柱后,各组分皆与固定相有强作用力,若使用一般流动相无法将他们洗脱下来,为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂(或称顶替剂)作流动相,当他注入色谱柱后,可迫使滞留在柱上的各个组分,依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来,且各谱带皆为各个组分的纯品。

第三节    高效液相色谱法的应用范围和局限性
一、应用范围
      高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物;生物活性物质和多种天然产物;合成的和天然的高分子化合物等。
      涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等,约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物,包括永久性气体,易挥发低沸点及中等分子量的化合物,只能用气相色谱法进行分析。
依据样品分子量和极性则要选择相应的HPLC分离方法


二、方法的局限性

高效液相色谱法虽具有应用范围广等的优点,但也有下述局限性:
1、在高效液相色谱法中,使用多种溶剂作为流动相,当进行分析时所需成本高于气相色谱法,且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时,它比气相色谱法的程序升温操作复杂。
2、高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器(热导检测器和氢火焰离子化检测器)。
3、高效液相色谱法不能替代气相色谱法,去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上,必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。
4、高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法,在200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品

综上所述可知,高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样,都不可能十全十美,作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点,使用范围和局限性的前提下,充分利用高效液相色谱法的特点,就可在解决实际分析任务中发挥重要的作用。
第二章  高效液相色谱基本概念

一、什么是高效液相色谱?
二、色谱过程
三、常用的基本术语

High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱法,简称:HPLC。是一种区别于经典液相色谱;基于仪器方法的高效能分离手段:高性能的色谱柱,高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。
广泛应用于各个领域:医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
在技术,理论及应用上仍处于发展阶段

色谱过程:指物质分子(被分离组分)在相对运动的
              两相(流动相和固定相)中的“分配”平衡过程

ü色谱过程:                    
    吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→ 差速迁移 → 分离



三、常用的基本术语
1、流出曲线和色谱峰
2、基线、噪音和漂移
3、峰宽——柱效参数
4、峰高和峰面积——定量参数
5、保留值——定性参数
6、分配系数和容量因子——相平衡参数
7、等温线
8、分离因子和分离度——分离参数

 
 





 
4.峰高和峰面积:色谱定量参数
p峰高(peak height;h):组分在柱后出现浓度 极大时的检测信号,即色谱峰顶至基线的 距离。
p峰面积(peak area;A):色谱曲线与基线间 包围的面积。

5.保留值:色谱定性参数
1)时间表示的保留值
§保留时间 retention time, tR:从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间,即组分通过色谱柱所需要的时间
§
§死时间dead time, t0:不被固定相滞留组分的保留时间,相当于流动相到达检测器所需要的时间
§调整保留时间tR’:组分由于和固定相作用,比不作用的组分在柱中多停留的时间,即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值




第三章    HPLC仪器介绍






p高压输液系统:储液罐、吸滤器、高压
      输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置
p进样系统:进样器,进样阀
p分离系统:色谱柱,恒温箱
p检测系统:检测器
p数据处理和计算机控制系统:记录装置、色谱工作站




流动相贮器俗称贮液瓶,它对大多数有机化合物呈化学惰性,耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料,容量约为0.5L~2.0L,通常无色透明,若流动相需避光,有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体,以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭,以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。

一、 高压输液系统
Ø流量准确可调、可调范围宽:流动相流速在0.5-1.5mL/min,输液泵的最大流量5-10mL/min
Ø耐高压:输出压力常达30-60MPa
Ø液流稳定。
Ø结构材料应耐化学腐蚀





一、 高压输液系统

3、脱气装置 :
将相对分子量小的气体从溶剂中除去


 
p流动相在使用前必须进行脱气处理,目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45μm或0.22μm滤膜过滤。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音,严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气,会造成荧光猝灭,影响荧光检测器的检测,还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种:

p1.超声波振动脱气   将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中,用超声波振荡10~30min。此法较简单、常用。
p2.抽真空脱气  用微型真空泵,降压至0.05~0.07Mpa既可除去溶解的气体,使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化,故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系,每种溶剂应预先脱气后再进行混合,以保证混合后的比例不变。
p3.加热回流脱气  用于需要彻底脱气的流动相(电化学检测器),因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失。此法的脱气效果较好,不提倡用于混合流动相。
p4.吹氦脱气  使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下,以60mL/min的流速缓缓地通过流动相10~15min,赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂,脱气效果较好,但价格较贵。
p5.真空在线脱气  把真空脱气装置串接到贮液系统中,并结合膜过滤器,实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系。

一、 高压输液系统
4、梯度洗脱装置:

梯度洗脱:在分离过程中逐渐改变流动相组成,如溶剂的极性、离子强度、pH值等。
为什么要进行梯度洗脱?
使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离






 
 
二、 进样系统
 
将样品溶液准确送入色谱柱的装置
  ——手动方式、自动方式
进样器要求

密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。

常用手动进样器——六通阀进样器



p自动进样装置 
     采用微处理机控制进样阀采样(通过阀针)、进样和清洗等操作。操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上(有转盘式、排式),然后输入程序(如进样次数、分析周期等),启动,设备将自行运转。
p三、色谱分离系统
    色谱分离系统包括保护柱、色谱柱、恒温装置和连接阀等。分离系统性能的好坏是色谱分析的关键。
p1、保护柱 
     为保护分析柱挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒,常在进样器与分析柱之间装上保护柱。保护柱是一种消耗性柱,一般只有5cm左右长,在分析50~100个比较脏的样品之后需要换新的保护柱芯。保护柱用分析柱的同种填料填装,但粒径要大得多,便于装填。


常见色谱柱的类型
专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产,除此外还有很多专业的色谱柱厂家。
C18—又称ODS柱,使用最普遍、规格多,适合大多数化合物的分析,市场上品种繁多,值得注意的是同样的C18柱,得到的结果可能非常不一致,尤其是极性或离子化合物。流动相为甲醇(乙腈)水系统。
C8—类同于C18柱,保留能力比C18差。
C4,C2,C1—反相,用于一些特定的化合物分析,寿命较短。
NH2—既能用于反相又可用于正相,常用于小分子的糖分析。
色谱柱的保护
1、在使用新柱之前,最好用有机溶剂在低流量下(0.2-0.3ml/min)冲洗30min,长时间未用的分析柱也要同样处理。
2、定期使用有机溶剂冲洗柱子。
3、使用缓冲盐时,要先用含5%-10%甲醇的水溶液冲洗,再用有机溶剂冲洗
4、净化样品
5、分离条件
6、不使用时,要盖上盖子,避免固定相干涸

p3、柱恒温箱 
p柱温是液相色谱的重要参数,精确控制柱温可提高保留时间的重现性。一般情况下较高柱温能增加样品在流动相的溶解度,缩短分析时间,通常柱温升高6℃,组分保留时间减少约30%;升高柱温能增加柱效,提高分离效率;分析高分子化合物或粘度大的样品,柱温必须高于室温;对一些具有生物活性的生物分子分析时柱温应低于室温。液相色谱常用柱温范围一般为室温至60℃。
四、 检测系统
用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置

溶质性检测器:仅对被分离组分理化特性响应
紫外、荧光、电化学检测器
总体检测器:对试样和洗脱液总理化性质响应
示差折光,电导检测器


 
原理:基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收
优点:①灵敏度高
         ②对温度和流速不敏感
         ③可用于梯度洗脱
缺点:仅适用于测定有紫外吸收的物质。



 
二极管阵列检测器的优点
①采集三维谱图
②峰纯度检验
③光谱库检索
④可以发现单波长检测时未检测到的峰





原理:基于被分析组分发射的荧光强度进行检测
优点:①灵敏度高,是最灵敏的检测器之一
         ②选择性好
         ③对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱
缺点:仅适用于测定可产生荧光的物质
可检测物质:多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、儿茶酚氨等(具有对称共轭体系)




原理:流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴,溶剂挥发后,溶质形成微小颗粒,被载气带到检测系统,进入散射室中,检测散射光的强度。
优点:消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移,可梯度洗脱,灵敏度高,是HPLC的通用型检测器。
缺点:不能使用不挥发性盐做流动相,如磷酸盐



原理:连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。
优点:通用型检测器
缺点:
①对温度变化敏感
②对溶剂组成变化敏感,不能用于梯度检测
③属于中等灵敏度的检测器

检测器
梯度
主要特点
紫外-可见光
对流速和温度变化敏感;池体积可制作得很小;对溶质的响应变化大。
荧光
选择性和灵敏度高;易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。
化学发光
困难
灵敏度高;发光试剂受限;受流动相和脉动的影响。
电导
不可
是离子性物质的通用检测器;受温度和流速影响;不能用于有机溶剂体系。
电化学
困难
选择性高;受流动相pH值和杂质的影响;稳定性差。
蒸发光散射
可检测所有物质。
示差折光
不可
检测所有物质;不适合微量分析;对温度变化敏感
质谱
主要用于定性和半定量。
原子吸收光谱
选择性高。
ICP发射光谱
可进行多元素同时检测。
火焰离子化
柱外峰展宽。





第一节  HPLC的固定相和流动相
第二节   HPLC方法及原理

一、固定相

1、要求:
Ø 粒径小、颗粒分布均匀
Ø 传质快、渗透压小
Ø 机械强度高、能耐高压
Ø 化学稳定性好

2、固定相载体

(1) 按承受压力分
刚性固体:硅胶为基质
           主要用于吸附、分配和键合色谱
硬   胶:以聚合物为基质
         主要用于离子交换和尺寸排阻色谱

2、固定相载体
2)按孔隙深度分
表面多孔型:实心玻璃珠为基体,基体表面覆盖一层多孔活性材料
                   适于常规分离分析
全多孔型:全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成
适于复杂混合物的分离。

3. 常用固定相
液固色谱固定相
   常用粒径3~10μm,理论塔板数过 5 万/米
Ø 无定形全多孔硅胶:YWG
Ø 球形全多孔硅胶:YQG
Ø 高分子多孔微球:YSG


3. 常用固定相
化学键合固定相
   以硅胶为载体,借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上

3. 常用固定相
化学键合固定相
Si-O-R:
热不稳定、易水解,适于不含水或醇的流动相
Si-R(或Si-N):
不水解,热稳定性较好。使用水溶液作流动相时,其pH应在4-8之间。
Si-O-Si-R:
不水解,热稳定性好,pH2-8范围内对水稳定


3. 常用固定相
化学键合固定相
Ø非极性键合相:十八烷基键合相(ODS,C18)
Ø中等极性键合相:醚基键合相
Ø极性键合相:氨基、氰基键合相
3. 常用固定相
其它固定相
Ø离子交换固定相:离子交换树脂、键合型离子交换树脂
Ø空间排阻色谱固定相:凝胶
Ø手性固定相:手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精
Ø亲合色谱固定相:生物专一性配基+载体

1、流动相要求
Ø对样品有适宜溶解度, k = 2 ~ 5;
Ø溶剂要与检测器匹配。
Ø高纯度、化学稳定性好
Ø适宜的粘度。过高柱压增加;过低易产生气泡
常用的低粘度溶剂:甲醇、乙腈等
粘度过低的溶剂:戊烷、乙醚等
2、流动相组成
按组成不同:单组分和多组分;
按极性:极性、弱极性、非极性;
按使用方式:固定组成淋洗和梯度淋洗
常用溶剂: 烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。

二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性

正相色谱:极性固定相——非极性流动相(加极性调节剂如氯仿)——极性柱(正相柱)

反相色谱:非极性键合固定相(ODS)——极性流动相——非极性柱(反相柱)

流动相可选水或一定pH缓冲液,加甲醇或乙腈调节极性)


 
 
按流动相和固定相特征分为
      正相色谱、反相色谱
按分离目的分为
      分析型、制备型
按分离机理分为
       吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。
一、建立HPLC分析方法的一般步骤

1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。
p材料来源、浓度范围
p组分特性、结构、分子量、溶解性等



 
2、选择合适的分析方法
p适用的色谱柱:柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径)
p流动相
p检测器
p样品预处理
3.分析条件的优化
p流动相种类与配比
p梯度
p温度
p流速
p检测波长
p进样量
4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。

1、定性分析
(1)色谱鉴定法:保留时间对照
        各物质在一定色谱条件下均有确定不变的保留时间,因此保留时间可作为定性指标。
应用范围:适用于简单混合物,对该样品已有了解并具有纯物质的情况。
优点:应用简便,不需要其它仪器。
缺点:定性结果的可信度不高

(2)与其他仪器或化学方法联合定性
混合物经色谱分析后,将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有:LC-FTIR、LC-MS等
其它仪器相当于色谱仪的检测器。
使用范围:复杂样品的定性。
优点:不需要标准物,定性结果可信度高,操作方便。
缺点:需要特殊仪器或设备。
二、HPLC定性定量分析方法
2、定量分析

1)色谱定量基础
色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。
(2)定量要解决的问题
峰面积的测量和计算
色谱定量方法及其应用

峰面积的测量和计算
积分仪或色谱工作站
简便、速度快,精度高,可达0.2-2%,对小峰及不对称峰的结果准确,是色谱发展趋势。
手动测量与计算

面积归一化法
应用范围:当试样中各组分都能流出色谱柱,且在检测器上均有响应,各组分峰没有重叠时,可用此法。
优点:简便、准确,当操作条件如进样量等变化时,对定量结果影响很小,该法适合于常量物质的定量。
缺点:对该法的苛刻要求限制了它的使用。

内标法
将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中。
适用范围:当只需测定试样中某几个组分,且试样中所有组分不能全部出峰时可用。
优点:受操作条件的影响较小,定量结果较准确,使用上不象归一化法那样受限制,此法适合于微量物质的分析。
缺点:每次分析必须准确称量被测物和内标物,不适合于快速分析。

外标法(标准曲线法)
用于常规分析
优点:操作简单,计算方便。
缺点:结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。
三、HPLC的应用

1、在食品分析中的应用
p食品营养成分分析:蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等;
p食品添加剂分析:甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等;
p食品污染物分析:霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。
2、在环境分析中的应用
 多环芳烃、农药(如氨基甲酸脂类)残留等。
3、在生命科学中的应用
      分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具
p低分子量物质:氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定
p高分子量物质:多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定
4、在医学检验中的应用
    体液中代谢物测定;药代动力学研究;临床药物监测:
p合成药物:抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等
p天然药物:生物碱(吲哚碱、强心甙)等
5、在无机分析中的应用
      阳、阴离子的分析等。





 
注意事项
1、流动相的配制
      所需玻璃仪器和容器,每次临用前需要用纯水清洗干净后,再用无水乙醇冲洗三次,阴(烤)干、冷却后方可使用。
     先抽滤、后超声(10-15分钟) 。
2、测定法要求
    样品进样前先混匀,再用0.45µm滤膜过滤,再混匀后进样。
    对照品与样品进样量要尽量保持一致。
    平行进针要求RSD<2%。
    进样针每次改进不同样品或对照品时,需用色谱甲醇涮洗五次以上,涮洗位置要超过进样量位置。
3、仪器使用过程中注意事项
    注意机器异常情况的发生(声音),压力是否过高(超过200Bar不可再做实验),流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。
4、实验完毕后
    用甲醇冲洗一小时,如果流动相中含有酸或缓冲盐,则先用新鲜纯水:甲醇=90:10的流动相冲洗0.5小时,再用甲醇冲洗一小时。

5、人参、西洋参等含量测定
    做波长小于240nm的样品时,注意机器、柱子一定要加长冲洗时间,乙腈则改用进口乙腈。
6、保留时间改变的样品
    用于实验时间加长,导致对照品与样品保留时间不一致时,在实验最后加进一针对照品,或采用对照品加样品同时进样的叠加法进样,对照峰面积是否为两者之和。