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液相色谱原理,维护,基础操作,处理方法


L、基线漂移
原因和解决方法
1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)
解决方法:控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图
2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)
解决方法:使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
解决方法:用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)
4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)
解决方法:取出阻塞物或换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
解决方法:更改配比或流速。为避免问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时
解决方法:用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
解决方法:检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法:使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
解决方法:重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法:将波长调整至最大吸收波长处

M、基线噪音(规则的)
原因 解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
解决方法:流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
解决方法:检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全
解决方法:用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)
解决方法:减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
解决方法:断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
6、泵振动
解决方法:在系统中加入脉冲阻尼器


N、基线噪音(不规则的)
原因 解决方法
1、漏液
解决方法:检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
解决方法:检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶
解决方法:选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
解决方法:断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
5、系统内有气泡
解决方法:用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡
解决方法:清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)
解决方法:用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
8、检测器灯能量不足
解决方法:更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞
解决方法:更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
解决方法:维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置


O、宽峰
 原因和解决方法
1、流动相组成变化
解决方法:重新制备新的流动相
2、流动相流速太低
解决方法:调节流速
3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)
解决方法:检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确
解决方法:调整设定
5、柱外效应影响
         a、柱子过载
         b、检测器对反应时间或池体积响应过大
         c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
         d、记录仪响应时间太长
解决方法:a、 小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品
          b、减少响应时间或使用更小的流通池
          c、 使用内径为0.007-0.01的短管路
          d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低
解决方法:增加浓度
7、保护柱污染或失效
解决方法:更换保护柱
8、色谱柱污染或失效,塔板数较低
解决方法:更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷
解决方法:打开柱入口,填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
解决方法:选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低
解决方法:提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大
解决方法:使用较小的时间常数

P、分离度降低
原因 解决方法
1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)
解决方法:重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞图
解决方法:去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。

 
Q、所有的峰面积都太小
原因 解决方法
1、检测器衰减设定过高
解决方法:减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
解决方法:设定较小的时间常数
3、进样量太少
解决方法:增大进样量
4、记录仪连接不当
解决方法:使用正确的连接

R、所有的峰面积都太大
原因 解决方法
1、检测器衰减设定过低
解决方法:采取较大的衰减
2、进样过多
解决方法:减少进样量
3、记录仪连接不正确
解决方法:正确连接记录仪

 HPLC日常维护办法之四:进样阀的问题
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
 A、手动进样阀,转动不灵
原因 解决方法
1、转子密封损坏
解决方法:更换或调整转子密封
2、转子太紧
解决方法:调整转子的松紧度
B、手动进样阀,载样困难
原因 解决方法
1、进样阀安装不当
解决方法:重新安装
2、定量环阻塞
解决方法:清洗或更换定量环
3、进样器污染
解决方法:清洗或更换进样器
4、管路阻塞
解决方法:清洗或更换管路
C、自动进样阀,不能转动
原因 解决方法
1、无压力(或电源)
解决方法:提供恰当的压力(电源)
2、转子太紧
解决方法:调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当
解决方法:重新安装
D、自动进样阀,其它问题
原因 解决方法
1、阻塞
解决方法:清洗或更换阻塞部件
2、机械故障
解决方法:见随机维修手册
3、控制器故障
解决方法:维修或更换控制器


(一)
保留时间变化        1.柱温变化        柱恒温
        2.等度与梯度间未能充分平衡        至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
        3.缓冲液容量不够        用>25mmol/L的缓冲液
        4.柱污染        每天冲洗柱
        5.柱内条件变化        稳定进样条件,调节流动相
        6.柱快达到寿命        采用保护柱
(二)
保留时间缩短        1.流速增加        检查泵,重新设定流速
        2.样品超载        降低样品量
        3.键合相流失        流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
        4.流动相组成变化        防止流动相蒸发或沉淀
        5.温度增加        柱恒温
(三)
保留时间延长       

1.流速下降        管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化        用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
        3.键合相流失        同前(二)3
        4.流动相组成变化        同前(二)4
        5.温度降低        同前(二)5
(四) 出现肩峰或分叉       

1.样品体积过大        用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强        采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道        更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效        更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏        更换进样器转子
(五)鬼峰       

1.进样阀残余峰        每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物        处理样品
3.柱未平衡        重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)                                                                    4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)        每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相)        通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水
(六) 基线噪声       

1.气泡(尖锐峰)        流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声)        清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声        更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声)        采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡        流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾       

1.柱超载        降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰        清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用        加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的 浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4        同前(四)4
5.同前(四)3        5.同前(四)3                                                                                                                                              6.死体积或柱外体积过大        连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降        用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽       

1.进样体积过大        同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展        进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢        设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大        设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高        增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大        用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长        等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大        将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载        进小浓度小体积样品

 a、流动相对样品具有一定的溶解能力
    b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
    c、流动相的黏度要尽量小
    d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应
    e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。
    f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。
    对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
    当选用最佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂,导致溶剂受污染。种被污染的溶剂如用于HPLC系统,可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变化,也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

    磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要贮存。如确需贮存,可在冰箱内冷藏,并在3天内使用,用前应重新滤过。容器应定期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子无此现象。

一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作:

    1、 防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏,而常用的方法是过滤,可采用Millipore滤膜(0.2um 或0.45um )等滤器。泵的入口都应该连接砂滤棒(或片),输液泵的滤器应经常换。

    2、 流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含有缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静止,就可能析出盐的微小晶体,些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此,必须泵入纯水充分清洗后,再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合固定相,可以是甲醇或甲醇和水)。

    3、 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完,否则空泵运转也磨损柱塞、密封环或缸体,最终产生漏液。

    4、 输液泵的工作压力不要超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变形,产生漏液。

    5、 流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大喊大量气泡,泵就无法工作。

    二、如果输液泵产生故障,须查明原因,采取相应的措施排除故障:

    1、 没有流动相流出,又无压力指示。原因可能是泵内有大量的气体,这时可打开泄压阀,使泵在较大的流量(5ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一50ml的注射器在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因可能是密封环磨损,需更换。

    2、 压力的流量不稳。原因可能是气泡,需要排除,或者是单向阀内有异物,可以卸下单向阀,浸入丙酮内,进行超声清洗。有时有可能是砂滤棒内有气泡或被盐的微小晶体粒或滋生的微生物部分堵塞,这时,卸下砂滤棒浸入流动相内,超声除气泡,或将砂滤棒(片)浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物或将盐溶解,再立即清洗。

    3、 压力过高的原因,是管路被堵塞,需要清除或清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时可以逐段进行。

一)保留时间变化

1.柱温变化 柱恒温,必要时需配置恒温箱

2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够 用>25mmol/L的缓冲液

4.柱污染 每天冲洗柱

5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相

6.柱快达到寿命 采用保护柱

(二)保留时间缩短

1.流速增加 检查泵,重新设定流速

2.样品超载 降低样品量

3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向

4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加 柱恒温

(三)保留时间延长

1.流速下降 管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱

3.键合相流失 同前(二)3

4.流动相组成变化 同前(二)4

5.温度降低 同前(二)5

(四) 出现肩峰或分叉

1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品

5.进样器损坏 更换进样器转子

(五)鬼峰

1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物 处理样品

3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂

5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水

(六) 基线噪声

1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压

2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声 更换氘灯

4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)

5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压

(七)峰拖尾

1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰 清洁样品,调整流动相

3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品

4.同前(四)4 同前(四)4

5.同前(四)3 同前(四)3

6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管

7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

(八)峰展宽

1.进样体积过大 同(四)1

2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点

4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相

6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小

9.样品过载 进小浓度小体积样品

    新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。
     卡套柱的安装(不加预柱)

    1.将卡套架套入柱芯

    2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见下图)

    3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片

    4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧

    5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

    6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手

    注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。
         卡套柱的安装(加预柱)
    1.将卡套架套入柱芯

    2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见下图)

    3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片

    4.将"子弹头"预柱放入卡套片内

    5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧

    6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

    7.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手

    更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱)

    注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

    1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端

    2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧

    3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网

    4.用一小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料

    5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平

    6.照(下图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端

    7.柱芯顶端套上2,然后参照(下图)将滤网放入

    8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平

    平衡色谱柱  反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。

    硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

    如何平衡色谱柱?

    平衡过程中,将流速缓慢地提高

    用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)

    色谱柱的再生   进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

    表1 建议用来冲洗的溶剂体积

    色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积
    125-4 1.6ml 30ml
    250-4 3.2ml 60ml                       
    250-10 -20ml 400ml

    请根据下表选择您的再生方法:

    极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的再生:

    正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

    非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:

    水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水

    0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

    注意:

    在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

    **如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

 

    色谱柱的维护

    1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)

    2.数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

    3.避免流动相组成及极性的剧烈变化

    4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理

    5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中

    6.压力升高是需要更换预柱的信号

色谱法,又称层析法。根据其分离原理,有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。
    
    吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同,用溶剂或气体洗脱,以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。
    
    分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同,以使组分分离。其中一相为液体,涂布或使之键合在固体载体上,称固定相;另一相为液体或气体,称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。
    
    离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。
    
    排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱,是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同,以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和试样的性质,选用水或有机溶剂为流动相。
    
    色谱法的分离方法,有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应,并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度,除气相色谱法或另有规定外,系指在室温下操作。
    
    分离后各成分的检出,应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时,可根据其色带进行区分,对有些无色物质,可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶,采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时,可将色谱斑点部分剪下或挖取,用溶剂溶出该成分,再用分光光度法或比色法测定,也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出,也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。 柱色谱法
    
    所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管,下端用棉花或玻璃纤维塞住,管内装有吸附剂。色谱柱的大小,吸附剂的品种和用量,以及洗脱时的流速,均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀,以保证良好的分离效果,除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响,应予注意。
    
    吸附剂的填装 干法:将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相,或将色谱管下端出口加活塞,加入适量的流动相,旋开活使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。湿法:将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管中,然后再加入流动相,将附着于管壁的吸附剂洗下,使色谱柱表面平整。 俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将柱表面相平时,即加试样溶液。
    
    试样的加入 除另有规定外,将试样溶于层析时使用的流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽后使呈松散状;将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。
    
    洗脱 除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相的品种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。
    
    纸色谱法
    
    以纸为载体,用单一溶剂或混合溶剂进行分配。亦即以纸上所含水分或其他物质为固定相,用流动相进行展开的分配色谱法。
    
    所用滤纸应质地均匀平整,具有一定机械强度,必须不含会影响色谱效果的杂质,也不应与所用显色剂起作用,以免影响分离和鉴别效果,必要时可作特殊处理后再用。 试样经层析后可用比移值(Rf)表示各组成成分的位置(比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比),由于影响比移值的因素较多,因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时,试样所显主色谱斑点的颜色(或荧光)与供置,应与对照(标准)样所显主色的谱斑点或供试品-对照品(1∶1)混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标(纯度)检查时,可取一定量的试样,经展开后,按各单体的规定,检视其所显杂质色谱斑点的数或呈色(或荧光)的强度。作为含量测定时,可将色谱斑点剪下洗脱后,再用适宜的方法测定,也可用色谱扫描仪测定。 1、下行法 所用色谱缸一般为圆形或长方形玻璃缸,缸上有磨口玻璃盖,应能密闭,盖上有孔,可插入分液漏斗,以加入流动相。在近缸顶端有一用支架架起的玻璃槽作为流动相的容器,槽内有一玻璃棒,用以支持色谱滤纸使其自然下垂,避免流动相沿滤纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。
   
    取适当的色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条,离纸条上端适当的距离(使色谱纸上端能足够浸入溶剂槽内的流动相中,并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线,必要时色谱纸下端可切成锯齿形,以便于流动相滴下。 将试样溶于适当的溶剂中,制成一定浓度的溶剂。用微量吸管或微量注射器吸取溶剂,点于点样基线上,溶液宜分次点加,每次点加后,俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。样点直径一般不超过0.5cm,样点通常应为圆形。

    将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内,并用玻璃棒压住,使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂,点样基线在支持棒下数厘米处。色谱开始前,色谱缸内用各单体中所规定的溶剂的蒸气饱和,一般可在色谱缸底部放一装有流动相的平皿,或将浸有流动相的滤纸条附着在色谱缸的内壁上,放置一定时间,俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加流动相,使浸没溶剂槽内滤纸,流动相即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开至规定距离后,取出滤纸,标明流动相前沿位置,俟流动相挥散后按规定方法检出色谱斑点。

    2、上行法 色谱缸基本和下行法相似,唯除去溶剂槽和支架,并在色谱缸盖上的孔中加塞,塞中插入玻璃悬钩,以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上。色谱滤纸一般长约25cm,宽度则视需要而定。必要时可将色谱滤纸卷成筒形。点样基线距底边约2.5cm,点样方法与下行法相同。色谱缸内加入适量流动相,放置,俟流动相蒸气饱和后,再下降悬钩,使色谱滤纸浸入流动相约0.5cm,流动相即经毛细管作用沿色谱滤纸上升,除另有规定外,一般展开至15cm后,取出晾干,按规定方法检视。

    色谱可以向一个方向进行,即单向色谱;也可进行双向色谱,即先向一个方向展开,取出,俟流动相完全挥发后,将滤纸转90°,再用原流动相或另流动相进行展。亦可多次展开,连续展或径向色谱等。


    薄层色谱法
     按各单体所规定的载体,放入适当容器,加入适量水以配成悬浮液,在厚度均匀一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上将此悬浮液均布成0.25mm的厚度,风干后一般在110度下干燥0.5-1h(或按单体规定)。
    以离薄层板一端约25mm的位置作为点样基线,用微量吸管按规定量吸取试样液和对照(标准)液,点于基线上,点与点之间的距离在10mm以上,液点的直径约3mm,风干后,基线一端向下,将薄层板放入展开溶剂,溶剂层深10mm,并预经开展溶剂的蒸汽饱和。在展开溶剂从基线上升至规定距离(一般为15cm)后,取出薄层板,风干,然后按规定的方法,对斑点的位置和颜色进行检查。


    气相色谱法
    气相色谱法是在以适当的固定相做成的柱管内,利用气体(载气)作为移动相,使试样(气体、液体或固体)在气体状态下展开,在色谱柱内分离后,各种成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱谱图。 在对装置进行调试后,按各单体的规定条件调整柱管、检测器、温度和载气流量。进样口温度一般应高于柱温30-50度。如用火焰电离检测器,其温度应等于或高于柱温,但不得低于100度,以免水汽凝结。色谱上分析成分的峰的位置,以滞留时间(从注入试样液到出现成分最高峰的时间)和滞留容量(滞留时间×载气流量)来表示。些在一定条件下,就能反应出物质所具有特殊值,并据此确定试样成分。
    
    根据色谱上出现的物质成分的峰面积或峰高进行定量。峰面积可用面积测定仪测定,按半宽度法求得(即以峰1/2处的峰宽×峰高求得)。峰高的测定方法是从峰高的顶点向记录纸横座标准垂线,找出此垂线与峰的两下端联结线的交点,即以此交点至峰顶点的距离长度为峰高。


    定量方法可分以下三种:

    1、内标准法 取标准被测成分,按依次增加或减少的已知阶段量,各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中,调制标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱,根据色谱图取标准被测成分的峰面积和峰高和内标物质的峰面积和峰高的比例为纵座标,取标准被测成分量和内标物质量之比,或标准被测成分量为横坐标,制成标准曲线。

    然后按单体中所规定的方法调制试样液。在调制试样液时,预先加入与调制标准液时等量的内标物质。然后按制作标准曲线时的同样条件下得出的色谱,求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰积或峰高之比,再按标准曲线求出被测成分的含量。

    所用的内标物质,应采用其峰面积的位置与被测成分的峰的位置尽可能接近并与被测成分以外的峰位置完
全分离的稳定的物质。

    2、绝对标准曲线法 取标准被测成分 按依次增加或减少阶段法,各自调制成标准液,注入一定量后,按色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高为纵座标,而以标准被测成分的含量为横坐标,制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法制备试样液。取试样液按制标准曲线时相同的条件作出色谱,求出被测成分的峰面积和峰高,再按标准曲线求出被测成分的含量。 3、峰面积百分率法 以色谱中所得各种成分的峰面积的总和为100,按各成分的峰面积总和之比,求出各成分的组成比率。


    气液色谱法

    这时指的气液色谱法,主要用于各种香料物质的分析,基本条件和参数主要依照美国精油协会(EOA)于1979年所建议的方法。其基本原理、操作、标准状态等均与上述气相色谱法相同。

    1、柱 用304号合金所制不锈钢管,长3m,内径2.16-2.57mm,外径3.18mm。底物:极性柱为聚乙二醇20M
(Carbowax 20M),分子量约2万;非极性柱为气相色谱级甲基硅氧烷(SE-30),或二甲基硅氧烷(OV-1或OV-101)。底物浓度:重量的105。固体载体:10目或20目熔融煅烧过的硅藻土,经硅烷化和酸洗后,其自由倾落密度为0.2g/cm3,最小120目,最大80目。装填密度每cm3应大于0.24g。

    2、载气 氦。最低流量为每分钟25-50ml。

    分析状态

    极性柱:起始温度,最低75度;最终温度,最高225度。升温速度,每分钟2-8度。
非极性柱:起始温度,最低75度;最终温度,不超过275度;升温速度,每分钟2-8度。
进样温度:225-250度。试样量:0.1-1ul。
检测器:用热导池。检测器的操作条件应维持恒定。


1、柱压升高;
  色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片,使用

1:1的硝酸溶液超声清洗5min,再用水、甲醇清洗除去水份。样品及流动相使用0.45μm滤膜除去微量杂质。使用流动相作溶剂配制样品。 

2、新柱柱效低
 柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好,影响传质过程。 换连接管,重新连接色谱柱,降低死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。 

3、旧色谱柱柱效低,分离不好,柱入口床层塌陷。
  填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料,流动相PH值在2—7范围内,否则可能被溶蚀。

4、旧色谱柱柱效低分离不好,有时出现双峰。
入门填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层,用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重,则废弃或重新填装。 

5、新柱接到仪器上后,柱头漏液。
  柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1/4圈直到不漏液为止。

6、新柱接到仪器上后,启动仪器没有柱压降。
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵,用流动相将柱内气体置换掉。

7、新柱接到仪器上后,检测器出口不断有小气泡出现。
①同上。② 流动相脱气不彻底特别是MeOH/H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。 

8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加,甚至超过仪器的耐压限。
  柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。 更换或清洗柱入口滤片;用0.45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。 

9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。
  ①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0.45μm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。  6O{G

10、使用—段时间后,柱效下降,分离不好。
①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷,用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。 

11、[b]柱使用一段时间后,柱效下降出现双峰。
  柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。 

12、柱使用—段时间后,柱效下降,出现峰拖尾。
  柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml,若效果不明显应废弃。

13、进样量增大与峰面积增加不成正比.即进样量与峰面积不是线性关系。
  样品在流动相中的溶解度小,只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。 

14、使用缓冲液作流动相时,柱压降升高很快。
  霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。  

15、用5μm颗粒填料柱时, 以MeOH/H20作流动相柱压较高。
  MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈/水体系使柱压降低,分离效率更好。 

16、长时间放置的色谱柱,出现双峰。
  柱床层出现干裂。 柱放置时,最好使用相应的溶剂充填好,防止受大的机械震动,如床层干裂应废弃掉。 

17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。
  强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。 不影响柱的性能。 

18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。
    柱中固定相流失所致。 ①更换色谱柱。②检查所用的色谱条件是否合适。 

19、在U V色谱图中,靠近死时间处出现负峰。
   ①进样时压力波动所致。②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。 ①采用阀进样。
②用流动相溶解样品。

全屏显示该表格 柱压升高 色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。
样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片,使用1:1的硝酸溶液超声清洗5min,再用水、
甲醇清洗除去水份。
样品及流动相使用0.45μm滤膜除去微量杂质。
使用流动相作溶剂配制样品。
新柱柱效低 柱外死体积大。
样品在流动相中溶解不好,影响传质过程。 更换连接管,重新连接色谱柱,降低死体积。
使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。
旧色谱柱柱效低,分离不好,柱入口床层塌陷。 填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。
对硅胶质填料,流动相PH值在2—7范围内,否则可能被溶蚀。
旧色谱柱柱效低分离不好,有时出现双峰。 入门填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。
刮除被污染的床层,用同型的填料填补柱效可部分恢复。
污染严重,则废弃或重新填装。
新柱接到仪器上后,柱头漏液。 柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1/4圈直到不漏液为止。
新柱接到仪器上后,启动仪器没有柱压降。 柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵,用流动相将柱内气体置换掉。
新柱接到仪器上后,检测器出口不断有小气泡出
现。 ①同上。
② 流动相脱气不彻底特别是MeOH/H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。
②配好流动相后一定要进行脱气处理。
新柱接到仪器上后柱压降不断增加,甚至超过仪器的耐压限。 柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒
菌堵塞)。 更换或清洗柱入口滤片;用0.45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。
进样次数增加柱压降逐渐增加。 ①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。
②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0.45μm过滤膜过滤样品。
②推荐使用流动相溶解样品。
使用—段时间后,柱效下降,分离不好。 ①柱填料被流动相溶解而流失。
②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷,用相同型号填料填补。
②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。
柱使用一段时间后,柱效下降出现双峰。 柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。
柱使用—段时间后,柱效下降,出现峰拖尾。 柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml,若效果不明显应废弃。
进样量增大与峰面积增加不成正比.即进样量与峰面积不是线性关系。 样品在流动相中的溶解度小,只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。
②样品的浓度不宜太大。
④进样量不宜过大。
使用缓冲液作流动相时,柱压降升高很快。 霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。
②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。
用5μm颗粒填料柱时, 以MeOH/H20作流动相柱压较高。 MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈/水体系使柱压降低,分离效率更好。
长时间放置的色谱柱,出现双峰。 柱床层出现干裂。 柱放置时,最好使用相应的溶剂充填好,防止受大的机械震动,如床层干裂应废弃掉。
流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。 强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。 不影响柱的性能。
柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。 柱中固定相流失所致。 ①更换色谱柱。
②检查所用的色谱条件是否合适。
在U V色谱图中,靠近死时间处出现负峰。 ①进样时压力波动所致。
②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。 ①采用阀进样。
②用流动相溶解样品。


液相色谱常见问题及处理方法
HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

1、样品量不足,解决办法为增加样品量

2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4、检测器衰减太多。调整衰减即可。

5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7、检测池中有气泡。解决办法为排气。

8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

9、流动相流量不合适。调整流速即可。

10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。

为什么HPLC柱柱压过高

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。

1、拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;

2、把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查;

3、将柱子的进出口反过来接在仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子,(此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动池)。时,如果柱压仍不下降,再检查;

4、换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系。 一般情况下,在进样器与保护柱之间接一在线过滤器便可避免柱压过高的问题,SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?

1、筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。

2、存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子

如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化

漂移现象

1、温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定

2、流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3、柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡

快速变化现象

1. 流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定

2、泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。

3、流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

HPLC 仪器问题

1、 我的HPLC泵压明显的偏高,请问可能的原因?

答:流速设定过高;流动相或进样中有机械杂质,造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞;流动相粘度过大;柱温过低;缓冲盐结晶;压力传感器故障。

2、 基线不稳,上下波动或漂移的原因是什么,如何解决?

答:a.流动相有溶解气体;用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气

  b.单向阀堵塞;取下单向阀,用超声波在纯水中超20分钟左右,去处堵塞物

  c.泵密封损坏,造成压力波动;更换泵密封

  d.系统存在漏液点;确定漏液位置并维修

  f.柱后产生气泡;流通池出液口加负压调整器

  g.检测器没有设定在最大吸收波长处;将波长调整至最大吸收波长处

  h.柱平衡慢,特别是流动相发生变化时;用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

3、 接头处为何经常漏液,如何处理?

答:接头没有拧紧;拧松后再紧,手紧接头以手劲为限,不要使用工具,不锈钢接头先用手拧紧,再用专用扳手紧1/4-1/2圈,注意接头中的管路一定要通到底,否则会留下死体积。接头被污染或磨损;建议更换接头。接头不匹配,建议使用同一品牌的配件。

4、 进样阀漏液是如何造成的?

答:a.转子密封损坏;更换转子密封

  b.定量环阻塞;清洗或更换定量环

  c.进样口密封松动;调整松紧度

  d.进样针头尺寸不合适,一般是过短;使用恰当的进样针(注意针头形状)

  e.废液管中产生虹吸;清空废液管

谱图问题

1、 问:造成峰拖尾的原因是什么,如何消除?

答:a.筛板阻塞;反冲色谱柱、更换进口筛板

  b.色谱柱塌陷;填充色谱柱

  c.有干扰物质的存在;使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱

  e.流动相PH值不合适;调整PH值,对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰

  f.样品与填料表面的溶化点发生反应;加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱柱

2、 问:造成峰分叉的原因是什么,如何消除?

答:保护柱或分析柱污染;取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相;改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。

3、 问:K值增加时,拖尾更严重,这是为什么?

答:反相模式,二级保留效应;

  a.加入三乙胺(或碱性样品)

  b.加入乙酸(或酸性样品)

  c.加入盐或缓冲剂(或离子化样品)

  d.更换一支柱子

4、 问:保留时间的波动有几种可能的原因?

答:温控不当;调节好柱温。流动相组分变化;防止流动相蒸发、反应等,做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡;在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。

液相色谱常用符号与术语表

ACN 乙腈 Acetonitrile

AUFS 满量程的吸光度单位 Absorbance units, full scale

As 峰不对称因子

B 二元流动相中的强溶剂;例如:反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇

BSA 牛血清白蛋白(蛋白质) Bovine serum albumin

CAF 咖啡因(中性溶质) Caffeine

CRF 色谱响应因子 Chromatographic response function;色谱图总分离度的定量指标

dc 色谱柱内径(cm)

DMOA 二甲基辛胺 Dimethyloctylamine

DNB 2,4-二硝基甲酰(基) 2,4-Dinitrobenzoyl

dp 色谱柱填料的粒度(cm)

DRYLAB 液相资源公司(LC Resources INC.)的计算机模拟软件。DRYLAB I用于等度预测,DRYLAB G用于梯度预测

F 流动相的流速(ml/min)

FC-113 1,1,2-三氟-1,2,2-三氯乙烷

GPC 凝胶渗透色谱法 Gel-permeation chromatography

HA 酸性溶质,能电离出A-

Hex 己烷 Hexane

hr 二相邻谱带之间的谷高

HVA 高香草酸 Homovanillic acid

h’ 峰高

h1,h2 相邻谱峰1和谱峰2的峰高

IEC 离子交换色谱法 Ion-exchange chromatography

IP 离子对 Ion-pair

IPC 离子对色谱法 Ion-pair chromatography

J 色谱峰强度参数

K’ 所给谱峰的容量因子,k’=(tR-t0)/t0=tR’/t0,tR=t0(1+k’)

k 梯度洗脱过程中,某溶质的k’的平均值或有效值

kw 以水做流动相k’的外推值

k1,k2 相邻谱峰1和谱峰2的容量因子

L 色谱柱长度(cm)

Lc 检测器流动池光路的长度(cm)

M 溶质的分子量

MC 二氯甲烷 Methylene chloride

MDST 混合设计统计技术 Mixture-design statistical technique;一种优化流动相的软件

MeOH 甲醇 Methanol

MTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl ether

MW 溶质的分子量

N 色谱柱塔板数

NAPA N-乙酰普鲁卡因胺 N-Acetylprocainamide(碱性溶质)

N0 检测器的基线噪音

ODS 十八烷基硅烷 Octadecylsilyl

P 色谱柱的压力降[通常以巴(bar)表示,也用psi;另外,也用作柱极性参数

PA 普鲁卡因胺 Procainamide(碱性物质)

PAH 聚芳香烃 Polyaromatic Hydrocarbon

PESOS 优化流动相的计算机软件(美国Perkin-Elmer产品)

pKa 溶质酸性常数的负对数;当pH=pKa时,溶质中有一半是电离的

Rk 保留值范围,Rk=(最末谱峰k’)/(最初谱峰k’)

RRM 相对分离度图(通常N=10000)

Rs 相邻二谱峰的分离度

S 当流动相中的%B改变时,测量溶质保留值的变化速率的参数

SAL 水杨酸 Salicylic Acid

SEC 尺寸排阻色谱法 Size-exclusion chromatography

S/N 信噪比 Signal to noise ratio

t 分离时间(min)(样品进样时t=0)

tp 梯度系统的滞后时间(min)

TBA 四丁基铵离子 Tetrabutylammonium ion

TEA 三乙胺 Triethylamine

THF 四氢呋喃 Tetrahydrofuran

tk 在用于校正等度洗脱溶剂强度的流动相离开梯度混合器时,梯度洗脱的时间

TLC 薄层色谱法 Thin-layer chromatography

TMA 四甲基铵 Tetramethylammonium(盐)

TMS 三甲基硅烷 Trimethylsilyl

t0 色谱柱的死时间(min)

tR 溶质的保留时间(min)

tG 梯度时间(min),即梯度开始至结束的时间

t1,t2 相邻谱峰1和谱峰2的保留时间(min)

ti 色谱图中第一峰的保留时间(min)

tf 色谱图中最末峰的保留时间(min)

△tg tf-ti

tx (tf-ti)/2

UV 紫外光

Vm 色谱柱的死体积(mL),Vm=t0F

VMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acid

wm 化合物的进样量

w1,w2 相邻谱峰1和谱峰2于半峰高处(W1/2)的宽度(min)

W1,W2 相邻谱峰1和谱峰2的基线宽度(min)

W1/2 半峰高处的谱带宽度

xd,xe,xn 溶剂选择参数,分别用于测定溶剂的酸度、碱度和偶极性的程度

? 分离因子,?=k2/k1

△? 梯度洗脱期间流动相成分的变化

?o 溶剂强度参数

? 化合物的克分子吸收系数

? 流动相的粘度(Pa?s)

? 流动相中强溶剂的体积份数

%B 二元流动相中强溶剂的体积百分比(%v)

液相色谱法简介

气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果,而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时,定性鉴定就很困难,这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上,引入了气相色谱的理论与技术,在70年代初建立了高效液相色谱分析法(以HPLC表示)。在常压下操作的液相色谱,分离一个样品往往长达几小时至几十小时,因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速,以缩短分离时间,但是结果失败了。根据液相色谱理论,因为随着载液(流动相)流速的提高,板高则增大,所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高,人们制成了细小(<10?m)而高效的填充物,从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小,柱压降显着增大,为了得到合理的载液流速,使用了高压;输液泵,使流速达到1~10mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用,70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱,以区别于经典液相色谱。高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。

高效液相色谱所用基本概念:

保留值等色谱分析有关术语,以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致;高效液相色谱所用基本理论:塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相,则速率议程H=A+B/?+C?。式中:纵向扩散项(分子扩散项)B/?对板高的影响与气相色谱不同,由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一,因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可知,气相色谱(GC)的流动相流速u增大时,板高H显着增大(即柱效显着降低),而液相色谱(LC)的流速增大时,板高增大不显着(即柱效降低不显着)。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能,此外,气相色谱的载气权数种,其性质差别也不大,对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多,性质差别也大,对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要,并且在选择流动相对应注意以下几点:流动相对样品有适当的溶解度,但不与样品发生化学反应,也不与固定液互溶;流动相的纯度要高(至少分析纯)、粘度要小,以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降;流动相应与所用检测器相匹配,不应对组分检测产生干扰作用。高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点,还由于它的流动相(载液)种类比气相色谱的流动相(载气)多,因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相,从机时可提高选择性。此外,液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。由于高效液相色谱法具有以上特点,它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大(大于400)的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物,而这些物质占化合物总数的75~80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。但是,高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面,还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法,因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短,相辅相成。

1.分离原理

凝胶色谱,又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同,其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同,它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径要比分子筛大得多,一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后,不同大小的样品分子(图14—2中以黑点表示)随流动相沿凝胶颗粒(图14—2中以空心圈表示)外部间隙和凝胶孔穴旁流过,体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻,因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用,小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞,因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样,试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱,从而实现分离目的。光凝胶色谱采用水溶液作流动相进,称为过滤凝胶色谱(HFC),而用有机溶剂为流动相时,称为凝胶渗透色谱(GPC)。

2.固定相

凝胶色谱的固定相凝胶,是含有大量液体(一般是水)的柔软而富于弹性的物质,是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。根据凝胶的交联程度和含水量的不同,分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶(如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等)交联度低,膨胀度大,容量大,可压宿,不能用于高压(使用压力低于3.5kg/㎝2或更低),主要用于含水体系的常压凝胶色谱,半硬质凝胶(如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶),容量中等,渗透性较高,压力可用到70kg/㎝2。适用于非水溶剂流动相;硬质凝胶(如多孔硅胶、多也玻球等),膨胀度小,不可压缩,渗透性好,可耐高压,适于高流速下操作。

3.流动相

在凝胶色谱中,为提高分率效率,多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1,2一二氯乙烷、氯仿、水等。

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤:

1)、过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜。

2)、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)、打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。

4)、进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。

5)、有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6)、调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。

7)、设计走样方法。点击file,选取select users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。

8)、进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。

9)、关机时,先关计算机,再关液相色谱。

10)、填写登记本,由负责人签字。

注意事项:

1)、流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)、柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。

3)、所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)、压力不能太大,最好不要超过2000 psi。


液相色谱柱的使用注意事项及再生

 

1、色谱柱的使用说明: 

 

(1)、色谱柱使用前注意事项:

色谱柱的储存液无特殊说明,均为评价报告所示的流动相。在使用前,一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。

(2)、流动相:

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯,配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则好,尤其是含盐的流动相。另外,装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0,BDS C18适合于碱性化合物,PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时,每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗,并完全置换掉原来所使用的流动相。

(3)、样品:

样品也要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时,所有的溶剂和样品应严格脱水。

 

2、色谱柱的保存

 

(1)、反相色谱柱每天实验后的保养:

使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。

(2)、长期保存色谱柱:

如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

 

3、色谱柱的再生

 

因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。

(1)、反相柱的再生:依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90 (V/V),乙腈,异丙醇作为流动相冲洗色谱柱,完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

(2)、正相柱的再生:依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

 

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

 

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高,如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加,属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外),可能的原因有如下几点:

(1)、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染;

(2)、色谱柱头的填料被样品污染;

(3)、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,形成结晶析出;

(4)、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下:

(1)、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头,将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟,后再用纯水超声10分钟,重新装入色谱柱。

(2)、如确定色谱柱头的填料被污染,将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。

(3)、如确定定是盐结晶,用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解,再换高浓度甲醇。

(4)、如果因PH值使用不当,很难恢复。


.流动相必须用HPLC级的试剂.
2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.
3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.
4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.

液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

    A、峰拖尾

     原因                                      解决方法
1、筛板阻塞                          1、a、反冲色谱柱  b、换进口筛板  c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷                        2、填充色谱柱
3、干扰峰                            3、a、使用更长的色谱柱   b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误              4、调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应图 

                                 5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂  b、更改色谱柱

    B、峰前延

     原因                               解决方法
1、柱温低                            1、升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当                2、使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载                          3、降低样品含量
4、色谱柱损坏                        4、见A1、A2

    C、峰分叉

       原因                                               解决方法
1、保护柱或分析柱污染图              

                                1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相               2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

    D、峰变形

      原因                              解决方法
1、样品过载                        1、减少样品载量

    E、早出的峰变形

        原因                             解决方法
1、样品溶剂选择不恰当           1、a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂

    F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

    原因                                 解决方法
1、柱外效应                   

                               1、a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)b、使用小体积的流通池。

    G、K’增加时,脱尾更严重

         原因                                       解决方法
1、二级保留效应,反相模式             

                                   1、a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品)d、更换一支柱子
2、二级保留效应,正相模式             

                                  2、a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入水(或多官能团化合物)d、试用另方法
3、二级保留效应,离子对           3、加入三乙胺(或碱性样品)

    H、酸性或碱性化合物的峰拖尾

      原因                                 解决方法
1、缓冲不合适         1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液  b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

    I、额外的峰

       原因                     解决方法
1、样品中有其他组份              1、正常
2、前一次进样的洗脱峰            2、a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速
3、空位或鬼峰          3、a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积

    J、保留时间波动

      原因                               解决方法
1、温控不当                           1、调好柱温
2、流动相组分变化                     2、防止变化(蒸发、反应等)
3、色谱柱没有平衡                     3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

    K、保留时间不断变化

     原因                                 解决方法
1、流速变化                          1、重新设定流速
2、泵中有气泡                        2、从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当                  3、a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相