高效液相色谱简介
高效液相色谱法（HPLC）诞生于20世纪60年代末期，是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱理论与实验方法进行优化改进而形成的，也被称为“高压液相色谱法”或“高速液相色谱法”[1]。与早期液相色谱相比，HPLC的填料颗粒粒径更小且分布更均匀，柱效能显著提高。然而，由于流动相在色谱柱中的流动阻力较大，因此需要采用高压输送方式。此外，HPLC的分析速度更快。HPLC融合了多项先进技术，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高以及流动相选择范围广等优点，适用于多种化合物的分离、分析和检测，在医学、药学、化学等领域得到了广泛应用[2-3]。
2二维液相色谱
传统一维液相色谱（1D-LC）的峰容量和分离度有限，难以满足复杂组分的全面分析需求，其自身特性也限制了分离任务的完成能力。在此背景下，多维液相色谱（MD-LC）应运而生。
GIDDINGS[4]率先提出了多维分离的概念。WANG等[5]、NYIREDY等[6]基于组分重叠的统计学理论证明：当色谱峰数量超过峰容量的37%时，分离度将显著下降；若要实现98%的完全分离，峰容量需达到色谱峰数量的100倍以上。这表明，一维液相色谱技术的改进存在天然局限性，难以满足复杂样品的分离分析需求。
相较于一维液相色谱（1D-LC），二维液相色谱（2D-LC）展现出显著的技术优势。该技术通过构建多维分离体系，可将色谱峰容量提升1～2个数量级，同时有效降低峰重叠现象，尤其适用于复杂基质样品的深度解析及痕量组分的高灵敏度检测。2D-LC系统创新性地集成两种正交分离机制，通过串联两根基于不同分离原理（如反相色谱与尺寸排阻色谱）的色谱柱，显著拓宽了分离选择性边界，突破了一维色谱在复杂样品分离中选择性不足的技术瓶颈。
2D-LC采用双液相分离系统协同工作模式：样品首先经第一维色谱柱进行预分离，产生的馏分直接或经适度处理后，在线导入第二维色谱柱进行二次分离。这种“分离接力”机制可将第一维色谱柱中未完全分离的共流出组分进一步拆分，显著提升分离效率。系统最终生成的二维色谱数据经计算机软件处理，可转化为直观的二维等高线图或三维立体图谱，不仅完整保留了两维分离的全部信息，还能通过可视化手段揭示复杂样品中各组分的分布特征与相互关系，为化学、生物等领域的深度分析提供了更丰富的信息维度。二维液相色谱系统的两维通常依据分子量、等电点、亲水性及特殊分子间亲和作用等不同性质，对样品组分进行分析，有效分离成分复杂的混合物。
3超高效液相色谱
超高效液相色谱（UPLC）是色谱分离科学的重要发展成果。它基于高效液相色谱（HPLC）的理论和分离原理，通过应用小颗粒填料、快速检测手段和紧凑型系统架构，显著提升了分析效率与分离效果。
Waters公司率先在UPLC技术上取得突破。该公司利用杂化颗粒技术合成1.7μm的填料，并通过严格筛分，搭配全新筛板和色谱柱硬件进行超高压装填。此外，还配备了超高压色谱泵、自动进样器（“针内针”探头）和高速检测器，解决了超高压下仪器的诸多问题。2004年，Waters公司推出了ACQUITY UPLC系统，其速度、灵敏度和分离度分别是传统HPLC的9倍、3倍和1.7倍。该系统可用于快速分析氨基酸，降低溶剂消耗，并且分析方法易于转移。Agilent公司开发了1.8μm的填料，并推出了1290 Infinity系列，其压力可达120 MPa，采用新技术流通池，能够在缩短分析时间的同时不损失分离性能。岛津公司则采用2.2μm的填料，推出了相关系统，具有高耐压和高温柱温箱的特点。至今，已有10家公司推出了基于亚2μm填料的UPLC产品。
目前，UPLC仪器已逐渐应用于液相色谱实验中。与相关文献对比，UPLC的优势十分明显。例如，WANG等[5]开发的UPLC方法，其分析时间远短于HPLC，且灵敏度更高。UPLC正以其卓越的性能，为科研和实际应用带来更多便利与可能。
4液相色谱优化系统
液相色谱固定相优化系统（POPLC）是基于Nyiredy提出的“PRISMA”原理开发的一种技术，通过组合不同固定相色谱柱来优化液相色谱条件[6]。该系统源于流动相研究中的棱镜理论，利用不同类型固定相色谱柱对待分离组分的不同保留特性，构建正交选择空间，从而显著提高优化效率。
德国Bischoff公司已成功开发出商品化的POPLC色谱柱及优化软件，提供包括C18、C30在内的五种不同类型填料，每种填料的短柱设有10～100mm的五种长度规格。通过五种选择性各异的单柱基础实验获取组分保留信息，再经软件模拟，可确定不同类型与长度色谱柱的串联组合，实现固定相层面的高效液相色谱分离条件优化。目前，关于POPLC的应用报道尚有限，主要涉及黄酮类化合物的分离、爆炸物的分析研究以及甲状腺激素中杂质的分析等[7-9]。
其优化方法如下：首先，通过等度洗脱确定被分析物在不同固定相中的保留时间，流动相的选择可基于经验或尝试。实验组的固定相需具有选择性差异，例如采用常规C18、增强极性C18、苯基、C30或氰基等固定相。由于不同固定相的作用和分离机理不同，被分析物的保留特性会有所差异。记录各物质在每根色谱柱上的保留时间等数据，并将其输入分析软件。软件将计算并分析得出最佳短柱搭配方案，根据建议调整流动相配比，从而实现目标物的分离分析。
5高效液相色谱检测技术的应用
5.1高效液相色谱在工业中的应用
在我国，化工厂、化纤厂等行业每年排放数百万立方米的含酸工业废水，其处理至关重要。目前常用的处理方法包括离子交换树脂和酸碱中和等，但在处理前需准确测定废水中酸的含量和种类，以选择合适的预处理方法。
董万祥等[10]针对工业废水中C12-C18酸类混合物展开研究。由于废水中目标酸含量低、无紫外吸收，且大量无机物干扰常规检测，导致无法采用紫外检测器分析。研究人员通过前处理结合高效液相色谱-CAD检测器，成功攻克了这一难题，建立了精密度好、检测限低的色谱方法。以1,3-二苯基脲为内标物进行加标回收实验，回收率为94.3%～108.9%，该方法可用于工业废水的分析。
丙烯酸、对甲基苯磺酸和甲基丙烯酸是石化废水中常见的有机酸。邢飞等[11]通过优化液相色谱条件，建立了快速分析石化废水中这三种有机酸的方法。优化后的最佳条件为：流动相为（93∶7,v/v）的缓冲溶液（0.08 mol/L KH₂PO₄，用磷酸调节pH=3）与乙腈，总流速1.0 mL/min，色谱柱为ZORBAX-SB-C18，柱温30℃，MWD检测器，检测波长195 nm，进样量10μL。该方法检测限低、分析时间短、准确度高、灵敏度好，适用于实际石化废水的快速分析与监测。
此外，赵镭等[12]采用高效液相色谱法测定了食品模拟物中苯二甲酸的迁移量，马永强等[13]通过该方法测定了发酵液中的有机酸，均取得了良好效果。
5.2高效液相色谱在药物含量测定中的应用
高效液相色谱法（HPLC）是药物含量测定的核心技术，兼具分离与检测功能，能有效消除药物杂质、制剂附加剂及共存药物的干扰，广泛应用于药物成分分析。其凭借专一性强、灵敏度高、快速简便的优势，尤其适用于复杂体系的定量分析，在干扰因素较多时展现出显著优越性。
关日晴[14]采用高效液相色谱法测定了盐酸洛美沙星滴眼液中的洛美沙星含量。实验条件为：C18柱为分离柱，流动相为0.02 mol/L酸溶液（用三乙胺调节pH值至2.6）-乙腈（体积比85∶15），检测波长287nm。洛美沙星进样量在0.48～0.72μg范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.9998），平均回收率为100.4%，重复进样的RSD为0.33%(n=6）。国内还开展了喹诺酮类等多种药物的测定研究，包括复方制剂、保健食品及饲料成分等。
5.3在非法添加药物检测中的应用
近年来，食品、药品、保健品及动物饲料等领域非法添加违禁药物的事件频发，严重威胁公众健康。在此背景下，高效液相色谱法（HPLC）在非法添加违禁药物的日常检查中发挥着关键作用。HPLC通过分离样品并结合二极管阵列检测器进行分析，可实现对样品中特定化学成分的初步判别。若条件允许，采用HPLC-MS联用等更先进技术进行深入分析，可进一步提高检测结果的准确性。通过有针对性的检测，能够快速、准确地识别非法添加物质，为监管部门提供有力支持，保障公众健康。
薛恒跃等[15]建立了化学官能团专属性鉴别方法与HPLC结合的技术，对抗癫痫类中药制剂中非法添加的苯巴比妥进行初步确认，并通过HPLC-质谱联用技术与对照品比对最终确认，结果准确无误。车宝泉等[16]采用Utimates XB-C18色谱柱进行梯度洗脱，以含0.1%醋酸的20 mmol/L醋酸铵溶液和甲醇为流动相，检测了10种减肥药。结果显示各色谱峰分离度良好，质谱分辨率达标，最小检出量为2～100 ng。
6结语
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱技术将继续在分析领域发挥关键作用。未来研究可进一步探索新型固定相材料、优化色谱条件以及开发更高效的检测器，以提升分析的灵敏度和准确性。同时，加强HPLC与其他分析技术的联用，如质谱联用，将有助于更深入地解析复杂样品中的成分，为化学分析提供更强大的技术支持。
发布时间：2025-12-18 
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